코로나바이러스 감염경과의 중증도에 대한 임상적, 기능적, 면역학적, 유전적 요인

프로그램의 목표:

1. COVID-19 및 포스트 코로나 증후군의 급성기 과정의 다양한 정도를 가진 환자의 임상 및 기능적 특성을 결정합니다.

   1.1. COVID-19 및 포스트 코로나 증후군의 급성기 과정이 다양한 정도의 환자에서 신경 장애의 특징을 연구합니다.

2. COVID-19 및 포스트 코로나 증후군의 급성기 경과가 다양한 환자의 면역학적 프로필을 연구합니다.
3. COVID-19 및 포스트 코로나 증후군의 급성기 경과가 다양한 환자의 유전적 프로필을 연구합니다.
4. COVID-19 심각도의 잠재적인 예측 요인을 식별합니다.
5. Post Covid 증후군의 발병을 예측할 수 있는 마커를 결정합니다.
6. 선택한 마커를 기반으로 COVID-19 결과 척도를 개발하여 포스트 코로나 증후군의 발병을 예방하기 위한 환자 관리 전술을 결정합니다.

이 연구에는 COVID-19에 대한 PCR 테스트에서 양성 반응을 보인 환자가 포함됩니다. 질병 경과의 급성기에 있는 환자는 공화당 COVID-19 치료 프로토콜에 따라 모니터링되고 치료됩니다. 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 환자는 연구에 포함됩니다. 후속 분석(임상 기능적, 유전적, 면역학적)에 필요한 자료 수집은 이 프로토콜에 따라 수행됩니다. 그 후 연구 프로토콜에 따라 필요한 모든 자료를 수집하여 질병 발생 시점으로부터 1년 이내에 환자를 관찰합니다.

임상 및 기능 분석:

PCR 분석을 이용한 COVID-19 바이러스의 RNA 검출. 표 1에 따라 복잡한 실험실 연구를 수행합니다.

일반 혈액 분석 5가지 세포 등급, 호중구와 림프구의 비율을 구분하는 분석기의 전체 혈구 수

혈액 화학 ALT, AST, 총 빌리루빈, 직접, LDH, CRP, 알파-아밀라아제, 크레아티닌, 요소, 포도당, 페리틴, 당화혈색소, ​​비타민 25 - OH 비타민 D, 비타민 B12

응고도 D-dimer, 피브리노겐, INR, APTT

기타 NT-pro BNP, Homocysteine, IL 6, Troponin, 혈액형 결정

연결된 면역흡착 분석 혈청, RBD에서 SARS-CoV-2 코로나바이러스(COVID-19)에 대한 IgG 및 IgM 항체 측정

기능 진단 • ECG

• EchoCG + 변형
• 폐 CT 스캔
• 홀터
• 스매드
• 신장 초음파
• 초음파
• 정맥 및 동맥의 도플러 초음파촬영
• Chalder Scale, EQ 설문지 표 1. 임상 및 기능 분석

신경 장애:

1. 신경학적 증후군(운동 장애, 인지 장애, 수면 장애, 무력증-우울 증후군 등)을 격리한 신경학적 검사.
2. 신경심리학적 방법 - 불안과 우울의 척도, MMSE 등 연구
3. 기악 방법 - EEG, polysonography, 목 혈관의 초음파, CT 관류.

4. 실험실 연구 방법:

   1. 일부 신경 특이 항원에 대한 항체 연구 - 수초 염기성 단백질(MBP), 신경 특이 에놀라아제(NSE).
   2. 세포성 면역(CD3+, CD4+, CD8+) 및 체액성 면역의 일반적인 지표(IgG, IgA, IgM, 순환 면역 복합체) 연구.

면역학적 분석:

면역 반응의 수준을 결정하기 위해 포괄적인 면역학적 분석이 수행될 것입니다. CD4 +, CD8 + 및 NK 세포의 수준 계산. 코로나 바이러스 S1, RBD 및 N의 단백질에 대한 IgG 및 IgM 클래스의 항체 수준은 Multiplex Immunoassay로 결정되었습니다. 면역학적 매개변수의 평가를 위해 샘플을 200μl의 인산염 완충액에 희석하고 원심분리한 다음 상청액을 제조업체의 프로토콜을 사용하여 분석합니다. MILLIPLEX MAP 인간 사이토카인/케모카인 자기 비드 패널은 다중 사이토카인 및 케모카인/면역글로불린 분석에 사용되며, Milliplex® 자기 비드 패널(HGAMMAG-301K-06, EMD Millipore Corp., Billerica, MA)이 사용됩니다. 면역글로불린 아이소타이핑을 위해. 샘플은 다음 지표에 대해 Bioplex BIO-RAD에서 분석됩니다: sCD40L, EGF, Eotaxin/CCL11, FGF-2, Flt-3 리간드, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN-α2, IFN-γ , IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC(CCL22), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, TGF-α, TNF-α, 유세포 분석법을 사용한 T 세포 및 B 세포 하위 집단의 면역 표현형 분석. B-림프구 및 T-림프구의 하위 집단은 전체 말초 혈액에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 형광색소에 접합된 단일 클론 항체로 염색하여 검사합니다. PBMC는 Ficoll 밀도 구배 원심분리 또는 특수 적혈구 용해 완충액을 사용하여 EDTA 처리 전혈에서 분리할 수 있습니다. 분리된 PBMC를 채혈 당일에 직접 분석하는 것이 더 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것이 바람직합니다. PBMC 생존력은 LIVE/DEAD™ 고정 죽은 세포 키트 또는 0.4% 트리판 블루 및 요오드화프로피듐 용액을 사용하여 평가될 것입니다. 적혈구 용해 및 단클론 항체와의 배양 후, 염색된 세포를 염색 배지에 재현탁하고 MoFlo Astrios 유세포 분석기(Beckman Coulter, USA)를 사용하여 검사합니다. 결과 데이터는 Summit(Beckman Coulter) 및 FloJo(Tree Star) 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다.

전방 및 측면 산란은 특정 형광색소의 신호 외에도 림프구 집단을 구별하는 데 사용됩니다. 분포 CD3-, CD5 +, CD19 + (총 B 림프구 수), CD5-, CD19 +, CD27 + (기억 B 세포), CD19 + CD27- (나이브 B 세포), CD19 + CD27 + CD38 + IgD - (Class-Switched Memory B-Cells) CD19 + CD27 + CD38 + IgD + (Unswitched Memory B-Cells)는 일반 림프구 집단에서 분석됩니다. 마커 CD3, CD4 및 CD8의 분포는 T-림프구 풀에서 분석됩니다. T 세포의 분화 상태를 분석하기 위해 항-CCR7, 항-CD45RO 항체로 세포를 추가적으로 염색하였다. 달리 명시되지 않는 한 항체는 Invitrogen ™에서 구입합니다.

유전자 분석:

제조업체의 지침에 따라 상업용 키트를 사용하여 전혈에서 DNA 분리(추출)를 수행합니다. 다수의 유전자 마커를 분석하기 위해 게놈-와이드 시퀀싱(genome-wide sequencing)을 진행한 후 코로나바이러스 수용체와 면역학적 인자를 코딩하는 후보 유전자의 유전적 다형성을 분석할 계획이다.

시퀀싱은 고처리량 차세대 시퀀싱 플랫폼 Illumina NovaSeq6000(Illumina), 전통적인 모세관 시퀀싱을 사용한 방법 검증 - ABI 3730XL ™ DNA Analyzer(Life Technologies), 실시간 PCR을 사용하여 수행됩니다.

Bioinformatics 데이터 분석.Bioinformatics sequencing 데이터가 분석됩니다. 시퀀싱 데이터의 생물정보학적 분석을 위한 소프트웨어 패키지(GATK, bwa, bowtie, bowtie2, VarScan 등)가 사용됩니다. 시퀀싱 데이터는 전 세계 게놈 연구의 국제 데이터베이스(https://www.covid19hg.org/, ExAC, HGMD(Human Gene Mutation Database), ESP, GeneBank, NCBI, ESP6500, 1000Genomes, SNPDb130, Ensembl, ClinVar, SNPedia 등). 조사 대상 그룹 간의 게놈 변이 유형 및 빈도의 차이가 결정됩니다.

검출된 유전자 변이를 분류하기 위해, 실리코 모델(SIFT_score/pred, Polyphen2_HDIVscore/pred, Polyphen2_HVAR_score/pred, LRT_score/pred, MutationTaster_score/pred, MutationAssessor_score/pred, FATHMM_score/pred, Radial/MetaRVM_score pred)이 사용됩니다. 임상적으로 유의한 유전적 변이체의 분류는 국제 ACMG/AMG 기준에 따라 수행될 것이다.

통계 분석:

통계 분석은 버전 R 3.6.2를 사용하여 수행됩니다. 임상, 생화학적, 분자 유전적 매개변수를 포함한 정량적 데이터는 Shapiro-Wilks 테스트를 사용하여 정규성을 확인하고 분포에서 매개변수로 인식됩니다. 평균 차이의 비교는 one-way ANOVA를 사용하여 수행하고 후속 쌍별 비교는 Tukey의 특수 테스트를 사용하여 수행합니다. 그룹 내 평균 차이는 대응 샘플 t-테스트를 ​​사용하여 수행됩니다. 그래프는 ggplot2 R 패키지를 사용하여 실행됩니다. 다중 분석 결과는 R psych 패키지와 standard t-test를 이용하여 통계 분석을 진행한다.

검사 빈도:

환자는 발병일로부터 12개월 동안 추적 관찰됩니다. 질병 감지는 기준선(0일)에 해당합니다. 진단 시 임상적, 기능적, 면역학적 진단을 위한 재료를 채취한다. 그 후, 샘플링은 연구 프로토콜에 따라 질병의 순간부터 다음 해 동안 매월 수행됩니다(그림 2). 유전자 분석을 위한 자료 수집은 1회 실시한다.