Facteurs cliniques, fonctionnels, immunologiques et génétiques sur la gravité de l'évolution de l'infection à coronavirus

Objectifs du programme :

1. Déterminer les caractéristiques cliniques et fonctionnelles des patients à des degrés divers d'évolution de la phase aiguë du COVID-19 et du syndrome Post Covid.

   1.1. Étudier les caractéristiques des troubles neurologiques chez les patients présentant des degrés divers d'évolution de la phase aiguë du COVID-19 et du syndrome post-Covid.

2. Étudier le profil immunologique des patients à des degrés divers de l'évolution de la phase aiguë du COVID-19 et du syndrome Post Covid.
3. Étudier le profil génétique des patients à des degrés divers de l'évolution de la phase aiguë du COVID-19 et du syndrome post-Covid.
4. Identifier les prédicteurs potentiels de la gravité de la COVID-19.
5. Déterminer les marqueurs permettant de prédire le développement du syndrome Post Covid.
6. Sur la base des marqueurs sélectionnés, développer une échelle de résultats COVID-19 pour déterminer les tactiques de prise en charge des patients pour prévenir le développement du syndrome post-Covid.

L'étude inclura des patients avec un test PCR positif pour COVID-19. Les patients en phase aiguë de l'évolution de la maladie sont suivis et traités conformément au protocole de traitement républicain COVID-19. Après avoir signé le consentement éclairé, le patient sera inclus dans l'étude. La collecte du matériel nécessaire aux analyses ultérieures (clino-fonctionnelles, génétiques, immunologiques) sera réalisée conformément à ce protocole. Par la suite, les patients sont observés dans un délai d'un an à compter du moment de la maladie conformément au protocole d'étude et à la collecte de tout le matériel nécessaire.

Analyse clinique et fonctionnelle :

Détection de l'ARN du virus COVID-19 par analyse PCR. Réalisation d'études de laboratoire complexes conformément au tableau 1.

Analyse sanguine générale Numération sanguine complète sur un analyseur avec différenciation de 5 classes de cellules, le rapport des neutrophiles aux lymphocytes

Chimie sanguine ALT, AST, bilirubine totale, directe, LDH, CRP, alpha-amylase, créatinine, urée, glucose, ferritine, hémoglobine glycosylée, vitamine 25 - OH vitamine D, vitamine B12

Coagulogramme D-dimères, fibrinogène, INR, APTT

Autre NT-pro BNP, Homocystéine, IL 6, Troponine, détermination du groupe sanguin

Dosage immuno-absorbant lié Détermination des anticorps IgG et IgM contre le coronavirus SARS-CoV-2 (COVID-19) dans le sérum sanguin, RBD

Diagnostic fonctionnel • ECG

• EchoCG + souche
• CT scan des poumons
• Holter
• SMAD
• Échographie rénale
• Ultrason
• Échographie Doppler des veines et des artères
• Échelle de Chalder, QE Questionnaire Tableau 1. Analyse clinique et fonctionnelle

Troubles neurologiques :

1. Examen neurologique avec isolement des syndromes neurologiques (troubles moteurs, cognitifs, troubles du sommeil, syndromes asthénico-dépressifs, etc.).
2. Méthodes neuropsychologiques - recherche sur les échelles d'anxiété et de dépression, MMSE, etc.
3. Méthode instrumentale - EEG, polysonographie, échographie des vaisseaux du cou, perfusion CT.

4. Méthodes de recherche en laboratoire :

   1. L'étude des anticorps dirigés contre certains antigènes neurospécifiques - la protéine basique de la myéline (MBP), l'énolase neurospécifique (NSE).
   2. Etude de l'immunité cellulaire (CD3+, CD4+, CD8+) et des indicateurs généraux de l'immunité humorale (IgG, IgA, IgM, complexes immuns circulants).

Analyse immunologique :

Une analyse immunologique complète sera effectuée pour déterminer le niveau de la réponse immunitaire. Calcul du taux de cellules CD4+, CD8+ et NK. Le niveau d'anticorps des classes IgG et IgM contre les protéines du coronavirus S1, RBD et N a été déterminé Multiplex Immunoassay. Pour l'évaluation des paramètres immunologiques, les échantillons sont dilués dans 200 µl de tampon phosphate, centrifugés et le surnageant analysé selon le protocole du fabricant. Le panel de billes magnétiques de cytokines/chimiokines humaines MILLIPLEX MAP sera utilisé pour l'analyse de plusieurs cytokines et chimiokines/immunoglobulines, et le panel de billes magnétiques Milliplex® (HGAMMAG-301K-06, EMD Millipore Corp., Billerica, MA) sera utilisé pour l'isotypage des immunoglobulines. Les échantillons seront analysés sur Bioplex BIO-RAD pour les indicateurs suivants : sCD40L, EGF, Eotaxin / CCL11, FGF-2, Flt-3 ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN-α2, IFN-γ , IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC (CCL22), MIP-1α, MIP-1β, PDGF- AA, PDGF-AB / BB, RANTES, TGF-α, TNF-α, Immunophénotypage des sous-populations de lymphocytes T et de lymphocytes B par la méthode de cytométrie en flux. Les sous-populations de lymphocytes B et T seront examinées en colorant les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) isolées du sang périphérique total avec des anticorps monoclonaux conjugués à des fluorochromes. Les PBMC peuvent être isolés à partir de sang total traité à l'EDTA en utilisant une centrifugation en gradient de densité Ficoll ou des tampons spéciaux de lyse des érythrocytes. Il est préférable d'analyser les PBMC isolés directement le jour du prélèvement sanguin, ce qui donne des résultats plus fiables. La viabilité des PBMC sera évaluée à l'aide de kits de cellules mortes fixes LIVE / DEAD ™ ou d'une solution de bleu trypan à 0,4% et d'iodure de propidium. Après lyse des érythrocytes et incubation avec des anticorps monoclonaux, les cellules colorées sont remises en suspension dans un milieu de coloration et examinées à l'aide d'un cytomètre en flux MoFlo Astrios (Beckman Coulter, USA). Les données obtenues seront analysées à l'aide des logiciels Summit (Beckman Coulter) et FloJo (Tree Star).

La diffusion avant et latérale sera utilisée pour distinguer la population de lymphocytes en plus du signal provenant de fluorochromes spécifiques. Distribution CD3-, CD5 +, CD19 + (nombre total de lymphocytes B), CD5-, CD19 +, CD27 + (cellules B mémoire), CD19 + CD27- (cellules B naïves), CD19 + CD27 + CD38 + IgD - (Class-Switched Memory B-Cells) CD19 + CD27 + CD38 + IgD + (Unswitched Memory B-Cells) seront analysés sur la population lymphocytaire générale. La distribution des marqueurs CD3, CD4 et CD8 sera analysée dans le pool de lymphocytes T. Pour analyser l'état de différenciation des lymphocytes T, les cellules sont en outre colorées avec des anticorps anti-CCR7, anti-CD45RO. Les anticorps seront achetés auprès d'Invitrogen™, sauf indication contraire.

Analyse génétique :

L'isolement (extraction) de l'ADN sera effectué à partir de sang total à l'aide de kits commerciaux conformément aux instructions du fabricant. Pour analyser un grand nombre de marqueurs génétiques, il est prévu de réaliser un séquençage pangénomique suivi d'une analyse des polymorphismes génétiques des gènes candidats codant pour les récepteurs du coronavirus et les facteurs immunologiques.

Le séquençage sera effectué à l'aide de plateformes de séquençage de nouvelle génération à haut débit Illumina NovaSeq6000 (Illumina), validation de méthode utilisant le séquençage capillaire traditionnel - Analyseur d'ADN ABI 3730XL ™ (Life Technologies), PCR en temps réel.

Analyse des données bioinformatiques. Les données de séquençage bioinformatique seront analysées. Les progiciels d'analyse bioinformatique des données de séquençage (GATK, bwa, bowtie, bowtie2, VarScan etc) seront utilisés. Les données de séquençage seront comparées aux données publiquement disponibles des bases de données internationales mondiales de recherche génomique (https://www.covid19hg.org/, ExAC, HGMD (Human Gene Mutation Database), ESP, GeneBank, NCBI, ESP6500, 1000Genomes, SNPDb130, Ensembl, ClinVar, SNPedia, etc.). Les différences dans le type et la fréquence des variations génomiques parmi les groupes étudiés seront déterminées.

Pour classer les variants génétiques détectés, des modèles in silico seront utilisés (SIFT_score/pred, Polyphen2_HDIVscore/pred, Polyphen2_HVAR_score/pred, LRT_score/pred, MutationTaster_score/pred, MutationAssessor_score/pred, FATHMM_score/pred, Radial/MetaRVM_score pred). La classification des variants génétiques cliniquement significatifs sera effectuée selon les critères internationaux ACMG/AMG.

Analyses statistiques:

L'analyse statistique sera effectuée à l'aide de la version R 3.6.2. Les données quantitatives, y compris les paramètres cliniques, biochimiques et génétiques moléculaires, seront vérifiées pour la normalité à l'aide du test de Shapiro-Wilks et reconnues comme paramétriques dans la distribution. La comparaison des différences moyennes sera effectuée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle, et la comparaison par paires ultérieure sera effectuée à l'aide du test spécial de Tukey. Les différences moyennes intra-groupe seront calculées à l'aide du test t pour échantillons appariés. Les graphiques seront exécutés à l'aide du package ggplot2 R. Une analyse statistique sera effectuée pour les résultats de l'analyse multiplex à l'aide du package R psych et des tests t standard.

Fréquence d'inspection :

Les patients sont suivis pendant 12 mois à compter de la date de la maladie. La détection de la maladie correspond à la ligne de base (jour 0). Au moment du diagnostic, du matériel est prélevé pour les diagnostics cliniques, fonctionnels et immunologiques. Après cela, l'échantillonnage est effectué tous les mois pour l'année suivante à partir du moment de la maladie conformément au protocole de l'étude (Figure 2). La collecte de matériel pour l'analyse génétique est effectuée une fois.