Czynniki kliniczne, funkcjonalne, immunologiczne i genetyczne wpływające na ciężkość przebiegu zakażenia koronawirusem

Cele programu:

1. Określenie charakterystyki klinicznej i czynnościowej pacjentów z różnym stopniem przebiegu ostrej fazy COVID-19 i zespołu Post Covid.

   1.1. Zbadanie cech zaburzeń neurologicznych u pacjentów z różnym stopniem przebiegu ostrej fazy COVID-19 i zespołu Post Covid.

2. Zbadanie profilu immunologicznego pacjentów z różnym stopniem przebiegu ostrej fazy COVID-19 i zespołu Post Covid.
3. Zbadanie profilu genetycznego pacjentów z różnym stopniem przebiegu ostrej fazy COVID-19 i zespołu Post Covid.
4. Zidentyfikuj potencjalne predyktory ciężkości COVID-19.
5. Określenie markerów pozwalających przewidzieć rozwój zespołu Post Covid.
6. Na podstawie wybranych markerów opracuj skalę wyniku COVID-19, aby określić taktykę postępowania z pacjentem, aby zapobiec rozwojowi zespołu Post Covid.

Badanie obejmie pacjentów z pozytywnym wynikiem testu PCR na obecność COVID-19. Pacjenci w ostrej fazie przebiegu choroby są monitorowani i leczeni zgodnie z republikańskim protokołem leczenia COVID-19. Po podpisaniu świadomej zgody pacjent zostanie włączony do badania. Pobranie niezbędnego materiału do dalszych analiz (kliniczno-czynnościowych, genetycznych, immunologicznych) będzie odbywać się zgodnie z niniejszym protokołem. Następnie pacjenci są obserwowani przez rok od momentu zachorowania zgodnie z protokołem badania iz pobraniem wszystkich niezbędnych materiałów.

Analiza kliniczna i funkcjonalna:

Wykrywanie RNA wirusa COVID-19 za pomocą analizy PCR. Przeprowadzenie kompleksowych badań laboratoryjnych zgodnie z tabelą 1.

Ogólne badanie krwi Pełna morfologia krwi na analizatorze z różnicowaniem 5 klas komórek, stosunek neutrofili do limfocytów

Chemia krwi ALT, AST, bilirubina całkowita, bezpośrednia, LDH, CRP, alfa-amylaza, kreatynina, mocznik, glukoza, ferrytyna, hemoglobina glikozylowana, witamina 25 - OH witamina D, witamina B12

Koagulogram D-dimerów, fibrynogen, INR, APTT

Inne NT-pro BNP, Homocysteina, IL 6, Troponina, oznaczanie grupy krwi

Test immunosorpcyjny powiązany Oznaczanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko koronawirusowi SARS-CoV-2 (COVID-19) w surowicy krwi, RBD

Diagnostyka funkcjonalna • EKG

• EchoCG + szczep
• Tomografia komputerowa płuc
• Holtera
• SMAD
• USG nerek
• Ultradźwięk
• Ultrasonografia dopplerowska żył i tętnic
• Skala Chaldera, Kwestionariusz EQ Tabela 1. Analiza kliniczna i funkcjonalna

Zaburzenia neurologiczne:

1. Badanie neurologiczne z wyodrębnieniem zespołów neurologicznych (zaburzenia ruchowe, poznawcze, zaburzenia snu, zespoły asteniczno-depresyjne itp.).
2. Metody neuropsychologiczne – badania na skalach lęku i depresji, MMSE itp.
3. Metoda instrumentalna - EEG, polisonografia, USG naczyń szyjnych, perfuzja TK.

4. Metody badań laboratoryjnych:

   1. Badanie przeciwciał przeciwko niektórym antygenom neurospecyficznym - zasadowemu białku mieliny (MBP), neurospecyficznej enolazie (NSE).
   2. Badanie odporności komórkowej (CD3+, CD4+, CD8+) oraz ogólnych wskaźników odporności humoralnej (IgG, IgA, IgM, krążące kompleksy immunologiczne).

Analiza immunologiczna:

Przeprowadzona zostanie kompleksowa analiza immunologiczna w celu określenia poziomu odpowiedzi immunologicznej. Obliczanie poziomu komórek CD4+, CD8+ i NK. Oznaczono poziom przeciwciał klas IgG i IgM przeciwko białkom koronawirusów S1, RBD i N w teście Multiplex Immunoassay. W celu oceny parametrów immunologicznych próbki rozcieńcza się w 200 μl buforu fosforanowego, odwirowuje i analizuje supernatant zgodnie z protokołem producenta. Panel kulek magnetycznych ludzkich cytokin/chemokin MILLIPLEX MAP zostanie użyty do analizy wielu cytokin i chemokin/immunoglobulin, a panel kulek magnetycznych Milliplex® (HGAMMAG-301K-06, EMD Millipore Corp., Billerica, MA) zostanie wykorzystany do izotypowania immunoglobulin. Próbki będą analizowane na Bioplex BIO-RAD pod kątem następujących wskaźników: sCD40L, EGF, Eotaxin/CCL11, FGF-2, Flt-3 ligand, Fractalkine, G-CSF, GM-CSF, GRO, IFN-α2, IFN-γ , IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-3, MDC (CCL22), MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, TGF-α, TNF-α, Immunofenotypowanie subpopulacji komórek T i B metodą cytometrii przepływowej. Subpopulacje limfocytów B i T będą badane poprzez barwienie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) wyizolowanych z pełnej krwi obwodowej przeciwciałami monoklonalnymi skoniugowanymi z fluorochromami. PBMC można izolować z krwi pełnej traktowanej EDTA przy użyciu wirowania w gradiencie gęstości Ficoll lub specjalnych buforów do lizy erytrocytów. Preferowane jest analizowanie wyizolowanych PBMC bezpośrednio w dniu pobrania krwi, co daje bardziej wiarygodne wyniki. Żywotność PBMC zostanie oceniona przy użyciu zestawów utrwalonych martwych komórek LIVE/DEAD™ lub 0,4% roztworu błękitu trypanu i jodku propidyny. Po lizie erytrocytów i inkubacji z przeciwciałami monoklonalnymi wybarwione komórki ponownie zawiesza się w pożywce barwiącej i bada przy użyciu cytometru przepływowego MoFlo Astrios (Beckman Coulter, USA). Uzyskane dane zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Summit (Beckman Coulter) i FloJo (Tree Star).

Do rozróżnienia populacji limfocytów oprócz sygnału z określonych fluorochromów zostanie użyte rozproszenie przednie i boczne. Dystrybucja CD3-, CD5 +, CD19 + (całkowita liczba limfocytów B), CD5-, CD19 +, CD27 + (komórki B pamięci), CD19 + CD27- (naiwne komórki B), CD19 + CD27 + CD38 + IgD - (komórki B pamięci z przełączeniem klas) CD19 + CD27 + CD38 + IgD + (komórki B pamięci z przełączeniem klas) będzie analizowane na ogólnej populacji limfocytów. Rozmieszczenie markerów CD3, CD4 i CD8 będzie analizowane w puli limfocytów T. Aby przeanalizować stan różnicowania komórek T, komórki dodatkowo barwi się przeciwciałami anty-CCR7, anty-CD45RO. O ile nie zaznaczono inaczej, przeciwciała zostaną zakupione w firmie Invitrogen™.

Analiza genetyczna:

Izolacja (ekstrakcja) DNA zostanie przeprowadzona z krwi pełnej przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z zaleceniami producenta. Aby przeanalizować dużą liczbę markerów genetycznych, planowane jest przeprowadzenie sekwencjonowania całego genomu, a następnie analiza polimorfizmów genetycznych genów kandydujących kodujących receptory koronawirusa i czynniki immunologiczne.

Sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone przy użyciu wysokowydajnych platform sekwencjonowania nowej generacji Illumina NovaSeq6000 (Illumina), walidacja metody z wykorzystaniem tradycyjnego sekwencjonowania kapilarnego – ABI 3730XL™ DNA Analyzer (Life Technologies), PCR w czasie rzeczywistym.

Analiza danych bioinformatycznych. Przeanalizowane zostaną dane sekwencjonowania bioinformatycznego. Wykorzystane zostaną pakiety oprogramowania do bioinformatycznej analizy danych sekwencjonowania (GATK, bwa, bowtie, bowtie2, VarScan itp.). Dane sekwencjonowania zostaną porównane z publicznie dostępnymi danymi ze światowych międzynarodowych baz danych badań genomicznych (https://www.covid19hg.org/, ExAC, HGMD (baza danych mutacji ludzkich genów), ESP, GeneBank, NCBI, ESP6500, 1000 genomów, SNPDb130, Ensembl, ClinVar, SNPedia itp.). Określone zostaną różnice w rodzaju i częstości zmienności genomowej pomiędzy badanymi grupami.

Do klasyfikacji wykrytych wariantów genetycznych wykorzystane zostaną modele in silico (SIFT_score/pred, Polyphen2_HDIVscore/pred, Polyphen2_HVAR_score/pred, LRT_score/pred, MutationTaster_score/pred, MutationAssessor_score/pred, FATHMM_score/pred, Radial/MetaRVM_score pred). Klasyfikacja istotnych klinicznie wariantów genetycznych zostanie przeprowadzona zgodnie z międzynarodowymi kryteriami ACMG/AMG.

Analiza statystyczna:

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu wersji R 3.6.2. Dane ilościowe, w tym parametry kliniczne, biochemiczne, genetyki molekularnej, zostaną sprawdzone pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilksa i uznane za parametryczne w rozkładzie. Porównanie średnich różnic zostanie przeprowadzone przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA, a następnie porównanie parami zostanie przeprowadzone przy użyciu specjalnego testu Tukeya. Średnie różnice wewnątrzgrupowe zostaną obliczone przy użyciu testu t dla sparowanych próbek. Wykresy zostaną wykonane przy użyciu pakietu ggplot2 R. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona dla wyników analizy multipleksowej przy użyciu pakietu R psych i standardowych testów t.

Częstotliwość kontroli:

Pacjenci są objęci obserwacją przez 12 miesięcy od daty zachorowania. Wykrywanie choroby odpowiada linii bazowej (dzień 0). W momencie rozpoznania pobierany jest materiał do diagnostyki klinicznej, czynnościowej i immunologicznej. Następnie pobieranie próbek odbywa się co miesiąc przez kolejny rok od momentu zachorowania zgodnie z protokołem badania (ryc. 2). Pobranie materiału do analizy genetycznej odbywa się jednorazowo.