Expressie en epigenetische uitschakeling van microRNA voor het voorspellen van therapeutische respons en prognose van HPV-negatieve HNSCC

Identificeer tumorspecifieke microRNA's (miR's) waarvan de expressie met meer dan 2 keer toeneemt of afneemt in verse tumor versus normaal slijmvlies op afstand van patiënten met plaveiselcelcarcinoom in het hoofd en de nek (HNSCC) negatief voor humaan papillomavirus (HPV)

SOLiD-sequencing van verse tumor-verre normale paren zal miR's ontdekken waarvan de expressie is veranderd in HNSCC-tumoren. SOLiD-sequencing zal volledig kwantitatieve gegevens opleveren voor de expressie van bekende en nieuwe miR's. Omdat HPV-gerelateerde tumoren ongeveer 20% van alle HNSCC uitmaken en biologisch verschillen van HPV-negatieve tumoren die klassiek geassocieerd zijn met tabak en alcohol, zal alleen HNSCC zonder p16-overexpressie worden gebruikt in dit ontdekkingsexperiment. Deze beperking zal de homogeniteit van de monsters vergroten en het vermogen om miR's te detecteren die verband houden met de etiologie van HPV-negatieve HNSCC. De geïdentificeerde miR's zullen worden gevalideerd met behulp van qPCR-assay in de tumor-normale paren en in p16-negatieve HNSCC-cellijnen (n>15). Bovendien zullen miR's waarvan eerder is gemeld dat ze ontregeld zijn in HNSCC, aan een vergelijkbare validatie worden onderworpen, zelfs als ze niet worden geïdentificeerd tijdens de SOLiD-sequencing-ontdekkingsfase.

Identificeer miR's waarvan de verminderde expressie in HPV-negatieve HNSCC het gevolg is van promotormethylering

miR's met verminderde expressie in tumorweefsel geïdentificeerd onder Uitkomst 1 zullen worden onderzocht op CpG-rijke promoters door de UCSC-database te controleren. De methylatiestatus van CpG-rijke promotors van miR's zal worden onderzocht door COBRA-assay in tumor versus normale paren (n=15) en in p16-negatieve HNSCC-cellijnen (n>15). De heterogeniteit van de methyleringsstatus over de CpG-rijke promotor zal worden gekarakteriseerd door bisulfaatsequencing met behulp van het COBRA PCR-product. Het uitschakelen van miR's door promotormethylering zal worden onderzocht door de gemiddelde miR-expressieniveaus tussen de methyleringscategorieën voor de tumor-normale paren en voor de HNSCC-cellijnen te vergelijken. Dit is vooral een beschrijvend onderzoek.

Definieer de statistische associatie tussen de expressie van tumorspecifieke miR's, miR-methylering en de therapeutische respons en prognose van HPV-negatieve HNSCC met behulp van medische patiëntendossiers

De therapeutische respons en prognose van HPV-negatieve HNSCC zullen worden verzameld uit twee bronnen: het patiëntendossier van de New Mexico Tumor Registry (NMTR) en uit het UNMH-medische dossier van de patiënt. qRT PCR zal worden ontworpen om de miR-expressie te kwantificeren in RNA dat is geëxtraheerd uit de met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels. Er zal een methyleringsspecifieke PCR (MSP) worden ontworpen om de grootschalige methyltypering in alle retrospectieve klinische monsters te vergemakkelijken. De primaire analyse zal worden uitgevoerd in HPV-negatieve HNSCC. Er zal een secundaire analyse worden uitgevoerd om alle HNSCC op te nemen, met en zonder overexpressie van p16. De status van p16-overexpressie wordt aangepast in de secundaire analyse. De associatie tussen miR-expressiestatus (hoog of laag) en miR-methyleringsstatus (ja of nee) en de PFS en OS van de patiënt zal worden onderzocht met behulp van Kaplan-Meier-overlevingsplots en de log-rank-test.