MEPHISTO (fenotyp makrofaga w zespole metabolicznym z przeciążeniem żelazem) (MEPHISTO)

MEPHISTO to badanie patofizjologiczne, poprzeczne, kliniczno-kontrolne, jednoośrodkowe (szpital uniwersytecki, Clermont-Ferrand, Francja). W ramach tego badania nie jest prowadzona żadna interwencja (lekowa ani żywieniowa), a uczestnicy nie podlegają żadnemu okresowi wykluczenia. Naszym celem jest zbadanie wpływu przeładowania żelazem na polaryzację monocytów/makrofagów i jej związku z czynnikami ryzyka sercowo-naczyniowego.

Badamy 60 przedmiotów podzielonych na 3 grupy po 20 uczestników:

• grupa DIOS złożona z osób z dysmetaboliczną hepatozyderozą
• grupa M złożona z osób z zespołem metabolicznym bez obciążenia żelazem
• grupa T złożona z osób szczupłych Osoby z grupy DIOS zostały wybrane spośród pacjentów niedawno zdiagnozowanych jako DIOS, bez wtórnej hiperferrytynemii iz obciążeniem wątroby żelazem potwierdzonym badaniem MRI wątroby.

Rekrutację grupy DIOS przeprowadzono w służbie chorób wewnętrznych. Osoby z grupy M i DIOS pochodzą z kartoteki ochotników z ośrodka badań klinicznych (CIC-501, Clermont-Ferrand). Osoby z grupy M do grupy DIOS są dobierane pod względem wieku, płci (+/- 5 kg/m²) oraz BMI. Osoby z grupy T do grupy DIOS są dobierane pod względem wieku i płci. Ponieważ nie przewiduje się żadnych bezpośrednich korzyści dla uczestników, otrzymują oni zryczałtowaną rekompensatę w wysokości 50 euro.

Każdy uczestnik przechodzi tylko 1 godzinną konsultację obejmującą badanie kliniczne i pobranie krwi.

Skupiamy się na parametrach klinicznych zespołu metabolicznego (obwód talii, BMI, ciśnienie krwi) oraz na poszukiwaniu czynników wykluczających (infekcja, nowotwór, leki przeciwzapalne). Ze względu na ich potencjalny wpływ na stan zapalny i stres oksydacyjny czynniki te, podobnie jak palenie tytoniu, zostały wykluczone.

Próbka krwi zostanie wykorzystana do wykonania:

• klasyczne badania laboratoryjne (morfologia, retikulocyty, ASAT, ALAT, LDH, profil lipidowy, glikemia, insulinemia, TSH, witamina D, ferrytyna, wysycenie transferyny, CRP),
• określone dawki (IL-6, TNFalpha, hepcydyna) metodą ELISA,
• fenotyp monocytów (CD14, CD16, CD 163, MR) metodą FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting),
• pomiar ekspresji genów z monocytów i makrofagów po hodowli metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Nasza główna analiza koncentruje się na polaryzacji monocytów ex vivo na alternatywne makrofagi (M2) i charakterystyce fenotypowej. Przed i po hodowli monocytów z (w celu indukcji makrofagów M2) lub bez IL-4 (w celu indukcji makrofagów rezydentnych) zmierzymy ekspresję fenotypowych markerów polaryzacji (MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb), markerów stanu zapalnego (TNFα , MCP-1, IL-6), markery stresu oksydacyjnego (HO-1) oraz markery metabolizmu żelaza (ferroportyna, ferrytyna, hepcydyna). Używamy ilościowej karty mikroprzepływowej PCR (TLDA, Taqman Low-Density Array) do pomiaru ekspresji genów monocytów i makrofagów typu M2. Technika ta umożliwia skrining ekspresji 24 genów. Wymagane są różne fazy: ekstrakcja RNA (zestaw RNeasy, Qiagen), odwrotna transkrypcja (zestaw RT-PCR, zestaw HighCap cDNA RT, Applied Biosystems), amplifikacja (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosystems) i wreszcie badanie genu wyrażenie (MFC TaqMan Array for GeneEx, Format 24, Applied Biosystems). Naszym głównym wynikiem jest zdolność do polaryzacji makrofagów M2 potwierdzona ekspresją MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb. Ocena wpływu obciążenia żelazem na dane z badania klinicznego, wyniki standardowej biologii i ekspresji genów monocytów jest naszym drugorzędnym wynikiem.