MEFISTO (makrofágový fenotyp u metabolického syndromu s přetížením železem) (MEPHISTO)

MEPISTO je patofyziologická, příčná, case-control, jednocentrická studie (univerzitní nemocnice, Clermont-Ferrand, Francie). V rámci této studie není prováděna žádná intervence (léková nebo nutriční) a účastníci nepodléhají žádnému období vyloučení. Naším cílem je zkoumat účinky přetížení železem na polarizaci monocytů/makrofágů a její vztahy s kardiovaskulárními rizikovými faktory.

Studujeme 60 předmětů rozdělených do 3 skupin po 20 účastnících:

• skupina DIOS složená ze subjektů s dysmetabolickou hepatosiderózou
• skupina M složená ze subjektů s metabolickým syndromem bez přetížení železem
• skupina T složená z štíhlých subjektů Účastníci skupiny DIOS byli vybráni z pacientů nedávno diagnostikovaných jako DIOS, bez sekundární hyperferritinémie as přetížením jater železem prokázaným MRI jater.

Nábor skupiny DIOS byl proveden na interní službě. Subjekty skupiny M a DIOS pocházejí ze souboru dobrovolníků z centra klinických studií (CIC-501, Clermont-Ferrand). Subjekty skupiny M a skupiny DIOS odpovídají věku, pohlaví (+/- 5 kg/m²) a BMI. Subjekty skupiny T až skupiny DIOS se shodují podle věku a pohlaví. Vzhledem k tomu, že se pro účastníky neočekává žádný přímý prospěch, obdrží paušální náhradu ve výši 50 eur.

Každý účastník absolvuje pouze 1 hodinovou konzultaci včetně klinického vyšetření a odběru krve.

Zaměřujeme se na klinické parametry metabolického syndromu (velikost pasu, BMI, krevní tlak) a hledání vylučovacích faktorů (infekce, neoplazie, antiflogistika). Vzhledem k jejich potenciálnímu vlivu na zánět a oxidační stres byly tyto faktory, stejně jako kouření, vyloučeny.

Vzorek krve bude použit k provedení:

• klasické laboratorní vyšetření (krevní obraz, retikulocyty, AST, ALAT, LDH, lipidový profil, glykémie, inzulinémie, TSH, , vitamin D, feritin, saturace transferinu, CRP),
• specifické dávky (IL-6, TNFalfa, hepcidin) pomocí ELISA,
• monocytární fenotyp (CD14, CD16, CD 163, MR) pomocí FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting),
• měření genové exprese z monocytů a makrofágů po kultivaci pomocí PCR v reálném čase.

Naše hlavní analýza se zaměřuje na ex vivo polarizaci monocytů na alternativní makrofágy (M2) a fenotypovou charakterizaci. Před a po kultivaci monocytů s (k indukci M2 makrofágu) nebo bez IL-4 (k indukci rezidentního makrofágu) změříme expresi fenotypových markerů polarizace (MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb), zánětlivých markerů (TNFα, MCP-1, IL-6), markery oxidačního stresu (HO-1) a markery metabolismu železa (ferroportin, feritin, hepcidin). K měření genové exprese monocytů a makrofágů typu M2 používáme kvantitativní PCR mikrofluidní kartu (TLDA, Taqman Low-Density Array). Tato technika umožňuje screening exprese pro 24 genů. Jsou vyžadovány různé fáze: extrakce RNA (RNeasy kit, Qiagen), reverzní transkripce (RT-PCR kit, HighCap cDNA RT kit, Applied Biosystems), amplifikace (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosystems) a nakonec studium genu expresi (MFC TaqMan Array pro GeneEx, formát 24, Applied Biosystems). Naším hlavním výstupem je schopnost polarizace v makrofázích M2 doložená expresí MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb. Hodnocení vlivu přetížení železem na data z klinického vyšetření, výsledky standardní biologie a genové exprese monocytů je naším sekundárním výstupem.