MEPHISTO (fenótipo macrófago na síndrome metabólica com sobrecarga de ferro) (MEPHISTO)

MEPHISTO é um estudo fisiopatológico, transversal, caso-controle, de centro único (hospital universitário, Clermont-Ferrand, França). Nenhuma intervenção (medicamentosa ou nutricional) é realizada como parte deste estudo e os participantes não estão sujeitos a nenhum período de exclusão. Nosso objetivo é investigar os efeitos da sobrecarga de ferro na polarização monócito/macrófago e sua relação com os fatores de risco cardiovascular.

Estudamos 60 sujeitos divididos em 3 grupos de 20 participantes:

• grupo DIOS composto por indivíduos com hepatosiderose dismetabólica
• grupo M composto por sujeitos com síndrome metabólica sem sobrecarga de ferro
• grupo T composto por indivíduos magros Os participantes do grupo DIOS foram selecionados entre pacientes com diagnóstico recente de DIOS, sem hiperferritinemia secundária e com sobrecarga hepática de ferro comprovada por ressonância magnética do fígado.

O recrutamento do grupo DIOS foi realizado no serviço de medicina interna. Os sujeitos do grupo M e DIOS vêm do arquivo de voluntários do centro de investigação clínica (CIC-501, Clermont-Ferrand). Sujeitos do grupo M ao grupo DIOS são pareados por idade, sexo (+/- 5 kg/m²) e IMC. Sujeitos do grupo T ao grupo DIOS são pareados por idade e sexo. Como não se espera nenhum benefício direto para os participantes, eles recebem uma remuneração única de 50 euros.

Cada participante passa por apenas uma consulta de 1 hora, incluindo um exame clínico e amostra de sangue.

Focamos nos parâmetros clínicos da síndrome metabólica (tamanho da cintura, IMC, pressão arterial) e na busca de fatores de exclusão (infecção, neoplasia, anti-inflamatórios). Devido à sua potencial influência na inflamação e no estresse oxidativo, esses fatores, assim como o tabagismo, foram excluídos.

A amostra de sangue será usada para realizar:

• exame laboratorial clássico (hemograma, reticulócitos, ASAT, ALAT, LDH, perfil lipídico, glicemia, insulinemia, TSH, , vitamina D, ferritina, saturação de transferrina, PCR),
• dosagens específicas (IL-6, TNFalfa, hepcidina) por ELISA,
• fenótipo de monócitos (CD14, CD16, CD 163, MR) por FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting),
• medição da expressão gênica de monócitos e macrófagos após cultura por PCR em tempo real.

Nossa análise principal foca na polarização ex vivo de monócitos em macrófagos alternativos (M2) e caracterização fenotípica. Antes e após o cultivo de monócitos com (para induzir macrófago M2) ou sem IL-4 (para induzir macrófago residente), mediremos a expressão de marcadores fenotípicos de polarização (MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb), marcadores inflamatórios (TNFα, MCP-1, IL-6), marcadores de estresse oxidativo (HO-1) e marcadores do metabolismo do ferro (ferroportina, ferritina, hepcidina). Usamos cartão microfluídico de PCR quantitativo (TLDA, Taqman Low-Density Array) para medir a expressão gênica de monócitos e macrófagos tipo M2. Esta técnica permite a triagem da expressão de 24 genes. Diferentes fases são necessárias: extração de RNA (kit RNeasy, Qiagen), transcrição reversa (kit RT-PCR, kit HighCap cDNA RT, Applied Biosystems), amplificação (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosystems) e, finalmente, o estudo do gene expressão (MFC TaqMan Array para GeneEx, Formato 24, Applied Biosystems). Nosso principal resultado é a capacidade de polarização em macrófagos M2 evidenciada pela expressão de MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb. Avaliar a influência da sobrecarga de ferro nos dados do exame clínico, os resultados da biologia padrão e a expressão gênica de monócitos é nosso desfecho secundário.