MEPHISTO (fenotipo macrofagico nella sindrome metabolica con sovraccarico di ferro) (MEPHISTO)

MEPHISTO è uno studio fisiopatologico, trasversale, caso-controllo, monocentrico (ospedale universitario, Clermont-Ferrand, Francia). Nessun intervento (farmaco o nutrizionale) è condotto nell'ambito di questo studio e i partecipanti non sono soggetti ad alcun periodo di esclusione. Il nostro obiettivo è quello di indagare gli effetti del sovraccarico di ferro sulla polarizzazione monociti/macrofagi e le sue relazioni con i fattori di rischio cardiovascolare.

Studiamo 60 soggetti divisi in 3 gruppi di 20 partecipanti:

• gruppo DIOS composto da soggetti con epatosiderosi dismetabolica
• gruppo M composto da soggetti con sindrome metabolica senza sovraccarico di ferro
• gruppo T composto da soggetti magri I partecipanti al gruppo DIOS sono stati selezionati tra pazienti recentemente diagnosticati come DIOS, senza alcuna iperferritinemia secondaria e con sovraccarico di ferro epatico dimostrato dalla RM epatica.

Il reclutamento del gruppo DIOS è stato effettuato nel servizio di medicina interna. I soggetti del gruppo M e DIOS provengono dall'archivio dei volontari del centro di ricerca clinica (CIC-501, Clermont-Ferrand). I soggetti dal gruppo M al gruppo DIOS sono abbinati per età, sesso (+/- 5 kg/m²) e BMI. I soggetti dal gruppo T al gruppo DIOS sono abbinati per età e sesso. Poiché non è previsto alcun vantaggio diretto per i partecipanti, essi ricevono un compenso forfettario di 50 euro.

Ogni partecipante viene sottoposto a una sola consultazione di 1 ora che include un esame clinico e un prelievo di sangue.

Ci concentriamo sui parametri clinici della sindrome metabolica (girovita, BMI, pressione arteriosa) e sulla ricerca dei fattori di esclusione (infezione, neoplasia, farmaci antinfiammatori). A causa della loro potenziale influenza sull'infiammazione e sullo stress ossidativo, questi fattori, così come il fumo, sono stati esclusi.

Il campione di sangue verrà utilizzato per eseguire:

• esami di laboratorio classici (emocromo, reticolociti, ASAT, ALAT, LDH, profilo lipidico, glicemia, insulinemia, TSH, vitamina D, ferritina, saturazione della transferrina, CRP),
• dosaggi specifici (IL-6, TNFalfa, epcidina) mediante ELISA,
• fenotipo monocitario (CD14, CD16, CD 163, MR) mediante FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting),
• misurazione dell'espressione genica da monociti e macrofagi dopo coltura mediante PCR in tempo reale.

La nostra analisi principale si concentra sulla polarizzazione ex vivo dei monociti in macrofagi alternativi (M2) e sulla caratterizzazione fenotipica. Prima e dopo la coltura di monociti con (per indurre il macrofago M2) o senza IL-4 (per indurre il macrofago residente), misureremo l'espressione di marcatori fenotipici di polarizzazione (MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb), marcatori infiammatori (TNFα, MCP-1, IL-6), marcatori dello stress ossidativo (HO-1) e marcatori del metabolismo del ferro (ferroportina, ferritina, epcidina). Utilizziamo la scheda microfluidica PCR quantitativa (TLDA, Taqman Low-Density Array) per misurare l'espressione genica dei monociti e dei macrofagi di tipo M2. Questa tecnica consente lo screening dell'espressione di 24 geni. Sono necessarie diverse fasi: l'estrazione dell'RNA (RNeasy kit, Qiagen), la trascrizione inversa (RT-PCR kit, HighCap cDNA RT kit, Applied Biosystems), l'amplificazione (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosystems) e infine lo studio del gene espressione (MFC TaqMan Array per GeneEx, Formato 24, Applied Biosystems). Il nostro risultato principale è la capacità di polarizzazione nei macrofagi M2 evidenziata dall'espressione di MR, CD200R, F13A1, CD163, AMAC1, TGFb. Valutare l'influenza del sovraccarico di ferro sui dati dell'esame clinico, i risultati della biologia standard e l'espressione genica dei monociti è il nostro risultato secondario.