CAPA-IVM kontra STANDARD IVM

Przygotowanie pacjentów

Do badania mogą zostać włączone pacjentki z PCOM: (1) kobiety z normalną długością cyklu miesiączkowego (≤35 dni) oraz (2) kobiety z rzadkim miesiączkowaniem (miesiączka występująca w odstępach >35 dni z 4-9 miesiączkami/rok) lub całkowity brak miesiączki. Pacjentki były pod obserwacją do końca ciąży.

Pacjentki mają pierwszą wizytę w poradni w 2. dniu cyklu miesiączkowego. Podczas tej wizyty pobrano krew do oceny FSH (hormonu folikulotropowego), LH (hormonu luteinizującego), estradiolu i progesteronu, a raz dziennie w godzinach popołudniowych otrzymują zastrzyk gonadotropinowy w dawce 150 IU (jednostka międzynarodowa). Wszyscy pacjenci zgłaszają się rano następnego dnia (dzień cyklu 3) na USG, a ostatnią dawkę gonadotropiny podano po południu (godz. 14.00). Kiedy wszystkie pęcherzyki miały średnicę <8 mm, podano kolejną dawkę gonadotropiny, a następnego dnia pacjentki zgłosiły się na USG, badania krwi i ostatnią dawkę gonadotropiny po południu (godz. 14:00). Maksymalna liczba wstrzyknięć gonadotropiny to trzy, a pobranie komórki jajowej u wszystkich pacjentek zaplanowano na 42-46 godzin po ostatnim wstrzyknięciu gonadotropiny. W dniu OPU (Oocyte Pick-up) wykonywane są badania USG i badania krwi w celu określenia poziomu FSH, LH, estradiolu i progesteronu. Podczas OPU mierzy się wielkość pęcherzyka przed punkcją. Większe pęcherzyki (≥6 mm) nakłuwa się najpierw, następnie igła przepłukuje, a następnie nakłuwa się mniejsze pęcherzyki (<6 mm). Dlatego każda probówka zawiera złożone doustne środki antykoncepcyjne (Cumulus-Oocyte Complex) o określonej wielkości (<6 lub ≥6 mm).

Hodowla oocytów

Oocyty od pacjentów z grupy CAPA-IVM są pobierane i przetwarzane w obecności CNP (C-type Natriuretic Peptide) jako inhibitora mejotycznego. W grupie CAPA-IVM, złożone doustne środki antykoncepcyjne umieszcza się na płytkach 4-dołkowych (Nunc, Dania) w ilości 10 COC/dołek, stosując pożywkę CAPA (pożywka Medicult IVM; Origio, Dania) uzupełnioną 1 mIU/ml rFSH, 5 ng/ml insulina, 10 nM estradiol, 10 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy [SAGE, Dania] i 25 nM (nanoMol) CNP pod olejem przez 24 godziny w 37°C, 6% dwutlenku węgla w powietrzu). Po 24 godzinach COC przemywa się i przenosi do pożywki IVM (Origio, Dania) zawierającej 5 ng/ml insuliny, 10 nM estradiolu, 100 ng/ml ludzkiej rekombinowanej amfireguliny i 100 mIU/ml rFSH (rekombinowany hormon folikulotropowy) i inkubuje w oleju przez 30 hw 37°C, 6% dwutlenku węgla w powietrzu.

W standardowej grupie IVM (kontrola), COC wysiano na 4-dołkową płytkę w ilości 10 COC/dołek, stosując pożywkę IVM uzupełnioną 75 mIU/mL rekombinowanego FSH (Merck, Szwajcaria), 100 mIU/mL hCG (MSD, USA) , 0,01 mg/ml hormonu wzrostu (Merck, Szwajcaria) i 10 mg/ml ludzkiej albuminy surowicy (SAGE, Dania). COC inkubuje się przez 30 godzin w tych samych warunkach fizycznych i atmosferycznych, co w przypadku grupy CAPA-IVM.

Zapłodnienie i hodowla zarodków

Po IVM dojrzałe oocyty są zapładniane za pomocą intracytoplazmatycznej iniekcji plemnika (ICSI) i hodowane w inkubatorze w temperaturze 37°C, 5% dwutlenku węgla, 5% tlenu. Kontrolę zapłodnienia przeprowadza się 16-18 godzin po ICSI. Zarodki hoduje się do dnia 3 w Global Total LP (Life Global, Kanada) w grupach po 2-3 zarodki na 30 ul mikrokropli. Zarodki, które spełniają kryteria zamrożenia, zostały zeszklone (Cryotech, Japonia) jako zarodki po rozszczepieniu dnia 3. Zarodki o wyjątkowo złej jakości (konsensus ze Stambułu w sprawie oceny jakości zarodków) określone jako fragmentacja >30%, <6 komórek i wielojądrowość nie są zamrażane.

Przygotowanie endometrium i transfer zarodków

Nie wykonuje się transferów świeżych zarodków. Pacjentki otrzymują doustnie estradiol w dawce 2 mg 4 razy dziennie od drugiego dnia cyklu miesiączkowego. Po okresie leczenia estradiolem trwającym co najmniej 10 dni i grubości endometrium ≥8 mm podaje się dopochwowo 200 mg progesteronu 4 razy dziennie. Transfer zarodków planowany jest 3 dni po rozpoczęciu podawania progesteronu. Beta hCG w surowicy bada się 14 dni po transferze zarodków. Jeśli kobieta zajdzie w ciążę, beta-ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG) > 5 mIU/ml, podawanie progesteronu utrzymuje się w tej samej dawce do co najmniej 11 tygodnia ciąży. Badanie ultrasonograficzne w celu określenia żywotności ciąży wykonuje się w 7 tygodniu ciąży.

Bezpieczeństwo procedury ART (Assisted Reproductive Technology) w PCOS

Bezpieczeństwo jest monitorowane podczas każdej wizyty w klinice lub w przypadku wystąpienia działań niepożądanych poprzez przesłuchanie i badanie pacjenta, a zdarzenia niepożądane i poważne zdarzenia niepożądane są odnotowywane w kartach przypadków. Zdarzenia niepożądane definiuje się jako wszelkie nieoczekiwane zdarzenia medyczne (objawy lub oznaki, nieprawidłowe wyniki badań laboratoryjnych lub choroby), które pojawiają się lub pogarszają podczas badania w stosunku do pierwszej wizyty w badaniu. Możliwe zdarzenia niepożądane, w tym ciąża pozamaciczna, poronienie, reakcje związane z lekami, takie jak przedawkowanie, nadwrażliwość i toksyczność, oraz wszelkie niepożądane skutki związane z pobieraniem komórek jajowych. Poważne zdarzenia niepożądane definiuje się jako każde nieoczekiwane zdarzenie medyczne, które spowodowało zgon, zagrożenie życia, wymagało hospitalizacji w szpitalu lub przedłużenia istniejącej hospitalizacji albo spowodowało trwałe lub znaczne kalectwo lub ubezwłasnowolnienie. Wrodzona anomalia lub wada wrodzona są uważane za poważne zdarzenia niepożądane.

Analiza statystyczna

Kluczowym celem tego badania jest określenie wykonalności, akceptowalności i zmienności wyników, aby pomóc w planowaniu większego badania skuteczności o odpowiedniej mocy. Planowana wielkość próby to 80 pacjentów (40 na grupę), co powinno pozwolić na stosunkowo precyzyjne wnioski dotyczące wykonalności wyników. Biorąc pod uwagę, że po raz pierwszy CAPA-IVM zastosowano klinicznie w naszym ośrodku, celem tego badania pilotażowego jest oszacowanie wskaźnika żywych urodzeń i powiązanych 95% przedziałów ufności (CI) dla nowej interwencji w praktyce klinicznej. Nieparametryczne metody statystyczne, takie jak suma rang Wilcoxona, są stosowane do wyników ciągłych lub porządkowych. Aby oszacować 95% przedziały ufności (CI) dla różnicy między dwiema medianami, stosuje się metodę ładowania początkowego i powiązane metody ponownego próbkowania. Częstość występowania wyników jest szacowana dla każdej leczonej grupy, a różnice między grupami analizowano przy użyciu względnego ryzyka (RR), 95% CI RR i dokładnego testu Fishera. Analizę podgrupy przeprowadza się na podstawie wielkości pęcherzyka (<6 w porównaniu z ≥6 mm). Dane przedstawiono jako wartości średnie z odchyleniem standardowym (SD), medianami i przedziałami międzykwartylowymi (IQR) lub proporcjami. Wszystkie analizy są wykonywane przy użyciu R (wersja 3.0.1; R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria). Istotność statystyczną określono jako p<0,05.