Radiogenomika w nowotworach dróg oddechowych

Jest to badanie prospektywne i badacze wykorzystują rutynowe próbki patologiczne do sekwencjonowania nowej generacji (NGS), niestabilności mikrosatelitarnej (MSI) i barwienia immunohistochemicznego.

Badania patologiczne, w tym PD-L1, status EGFR, ALK i ROS-1.

NGS (sekwencjonowanie nowej generacji): Całkowite DNA wyekstrahowano z krwi żylnej obwodowej z dodatkiem EDTA i próbek guza zatopionych w parafinie, odpowiednio za pomocą zestawu QIAamp® DNA Blood Mini Kit i QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Niemcy). W przypadku całej sekwencji egzomu DNA, w skrócie, DNA nowotworu i krwi poddano sonikacji za pomocą sonikatora Covaris M220 (Life Technologies Europe, Gent, Belgia), a następnie zligowano z adapterem w celu dalszej amplifikacji (Illumina® TruSeq Exome Library Prep, USA). Całość przygotowania biblioteki została przeprowadzona w Cancer Translational Core Facility Uniwersytetu Medycznego w Tajpej. Po przygotowaniu biblioteki wszystkie próbki zsekwencjonowano przy użyciu systemu NextSeq500 zgodnie z instrukcjami producenta (Illumina, San Diego, USA). Po wydajności sekwencjonowania jakość pliku odczytów (fastq) została oceniona przez FastQC, a następnie zmapowana przy użyciu ludzkiego Hg19 jako odniesienia. Pliki Bam zostały użyte jako dane wejściowe dla algorytmu Varscan w celu identyfikacji mutacji germinalnych i somatycznych. Warianty z adnotacjami i filtrowane zostały ręcznie sprawdzone przy użyciu IGV (Integrative Genomics Viewer), a następnie potwierdzone sekwencją Sangera.

Aby obliczyć TMB (całkowite obciążenie mutacjami) na megabazę, całkowitą liczbę zliczonych mutacji dzieli się przez rozmiar regionu kodującego docelowego terytorium.

Aby obliczyć MATH (heterogeniczność zmutowanych alleli guza), badacze najpierw uzyskają MAF (frakcję DNA, która pokazuje zmutowany allel w locus genu) dla każdej próbki guza. Rozkład MAF zostanie wykorzystany do obliczenia mediany (środek rozkładu) i MD (odchylenie mediany) MAF w guzie. MD określa się przez uzyskanie bezwzględnych różnic wszystkich MAF z mediany MAF. Następnie medianę bezwzględnych różnic mnoży się przez współczynnik 1,4826, aby uzyskać MD. Wartość MATH jest obliczana jako stosunek procentowy MD do mediany: MATH = (MD/mediana)×100.

MSI (niestabilność mikrosatelitarna) Niestabilność mikrosatelitarna reakcja łańcuchowa polimerazy (MSI-PCR) Testy MSI-PCR zostały przeprowadzone przez Cancer Translational Core Facility Uniwersytetu Medycznego w Tajpej przy użyciu zestawu do analizy Promega MSI (Promega). Analiza MSI składa się z pięciu prawie monomorficznych markerów mononukleotydowych (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 i MONO-27) do oznaczania MSI. Analizę MSI przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (Promega). Produkty analizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej, a badacze zinterpretowali niestabilność mikrosatelitarną w 2 lub więcej z 5 loci mononukleotydowych jako wysoki MSI, niestabilność mikrosatelitarną w pojedynczym locus mononukleotydowym jako niski MSI, a brak niestabilności w żadnym z loci jako stabilny mikrosatelitarnie ( MSS).

Cechy obrazu FDG PET, które badacze wyodrębnili w następujący sposób:

Tradycyjne parametry obrazu obejmują SUVmax, metaboliczną objętość guza (MTV) i całkowitą glikolizę zmian chorobowych (TLG) guza pierwotnego. Tradycyjne parametry FDG PET obliczono przy użyciu komercyjnego oprogramowania (PBAS, PMOD 4.0). Radiomika (analiza tekstury) zostanie obliczona tylko dla wstępnej obróbki FDG PET. Macierze analizy radiomicznej obejmują analizę histogramu, macierz współwystępowania na poziomie szarości (GLCM), macierz współwystępowania kodowania cech tekstury (TFCCM), macierz długości przebiegu na poziomie szarości (GRLLM), macierz stref wielkości na poziomie szarości (GLSZM )、Macierz różnic odcieni szarości sąsiedztwa (NGTDM)、Matryca kodowania cech tekstury (TFCM)、Matryca współwystępowania kodowania cech tekstury (TFCCM) i macierz zależności sąsiednich poziomów szarości (NGLD).