Wpływ probiotyków i suplementacji witaminą D na wyniki sportowe u sportowców MMA.

Badanie zostało zaprojektowane jako randomizowane, podwójnie ślepe badanie kliniczne kontrolowane placebo z 4-tygodniowym okresem interwencji probiotyków i witaminy D. Badanie prowadzone jest od grudnia 2020 do marca 2021 roku w Gdańskim Uniwersytecie Medycznym w Zakładzie Bioenergetyki i Fizjologii Wysiłku (Gdańsk). Badacze zapiszą 25 wyszkolonych mężczyzn uprawiających mieszane sztuki walki. Zarejestrowani sportowcy zostaną losowo przydzieleni do otrzymywania probiotyku (PRO) lub odpowiedniego placebo (PL) w stosunku 1:1, przy użyciu generatora liczb losowych Excel, zgodnie z zasadą losowości i ślepoty.

Badany produkt to mieszanka witaminy D ,,Juvit d3" i probiotyku ,,Sanprobi Active & Sport", zawierająca 2,5 x 109 CFU/g w kapsułce (≥500 mln CFU w jednej kapsułce) pięciu szczepów bakterii kwasu mlekowego (Bifidobacterium lactis W51, Lactobacillus brevis W63, Lactobacillus acidophilus W22, Bifidobacterium bifidum W23 i Lactococcus lactis W5); skrobia kukurydziana, maltodekstryna, białka roślinne i hydroksypropyloetyloceluloza otoczka tabletek. Identycznie wyglądające kapsułki placebo zawierające 40 mg maltodekstryny i białka roślinne zostaną wykorzystane w kartelu. Każde opakowanie probiotyku lub placebo zawiera 40 kapsułek. Podczas wizyty wyjściowej wszyscy sportowcy otrzymają butelkę Juvit d3 oraz trzy identycznie wyglądające opakowania probiotyków lub placebo, w zależności od losowego przydziału. Uczestnicy zostaną poinformowani o przyjmowaniu 4 kapsułek z posiłkami i 3500 j.m. witaminy D dziennie.

Podczas wizyty wyjściowej wszyscy uczestnicy otrzymają badany produkt, a także dzienniczek suplementów oraz dzienniczek spożycia i treningu. Wizyta PRE i POST będzie rozłożona na dwa dni w celu rzetelnego i właściwego wykonania wszystkich procedur. Okno czasowe między tymi podzielonymi wizytami wynosi 3-5 dni. Uczestnicy będą zgłaszać się do Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego na początku (PRE) i na końcu (POST) 4-tygodniowego okresu interwencyjnego. Podczas obu wizyt sportowcy dokonają oceny składu ciała, kwestionariusza częstotliwości posiłków (FFQ), oceny wydolności krążeniowo-oddechowej oraz przekażą próbki kału. Ponadto pobrane zostaną próbki krwi przed i po testach sportowych w celu oceny wybranych markerów stanu zapalnego i uszkodzenia mięśni oraz stopnia wykorzystania mleczanów. Ostatnie pobranie krwi odbędzie się po 24 godzinach beztlenowej próby sportowej. Uczestnik zostanie poinstruowany, aby kontynuować program szkolenia. Sportowcy będą zobowiązani do wykonania co najmniej 5 treningów wytrzymałościowych tygodniowo, aby zachować konkurencyjny charakter badania.

Analiza składu ciała zostanie oceniona w celu wykrycia potencjalnych zmian w masie tkanki tłuszczowej i beztłuszczowej. Poziom każdej tkanki zostanie porównany z zawartością bakterii jelitowych. Badacze spróbują wyjaśnić, czy skład mikrobiomu jelitowego może wpływać na skład ciała i jakie typy bakterii odpowiadają za ewentualne zmiany. Cel ten zostanie osiągnięty poprzez wieloczęstotliwościową analizę impedancji bioelektrycznej (BIA).

Wydolność tlenowa zostanie oceniona za pomocą ergometru rowerowego ER900 Jaeger z wykorzystaniem protokołu wassermana. Test zostanie poprzedzony 5-minutową rozgrzewką z obciążeniem 100 W, po której nastąpi 5-minutowy odpoczynek. Badanie rozpocznie się przy obciążeniu 125 W i częstotliwości 60 ± 5 obr./min, obciążenie będzie zwiększane co 1 minutę o 25 W. Badanie będzie prowadzone do momentu osiągnięcia maksymalnego indywidualnego obciążenia wysiłkowego, tj. niezdolności do ćwiczeń kontynuowanie ćwiczeń z zachowaniem określonej częstotliwości lub brak zwiększenia poboru tlenu. Podczas badania badacze będą monitorować ilość pobieranego tlenu i wydychanego dwutlenku węgla, minutową wentylację płuc oraz tętno. Próba tlenowa zostanie przeprowadzona 3-5 dni przed oceną beztlenową w ramach wizyt PRE i POST.

Ocena wydolności beztlenowej zostanie uzyskana za pomocą testu Wingate Anaerobic Test (WAnT) przy użyciu cykloergometru MCE_v_5.1. Przed badaniem siodełko zostanie indywidualnie wyregulowane, następnie zawodnicy wykonają 5-minutową rozgrzewkę przy obciążeniu 50 W i częstotliwości 60 RPM/min, z dwoma 10-sekundowymi przyspieszeniami w 3 i 4 minuty. Po rozgrzewce przewidziany jest 3-minutowy odpoczynek. Obciążenie będzie dobierane indywidualnie i wyniesie 7,5% masy ciała zawodnika. Na komendę „start” zawodnik wykona 30-sekundowy sprint w pozycji siedzącej, starając się jak najszybciej osiągnąć moc szczytową i utrzymać ją przez cały czas trwania wysiłku. Po teście nastąpi aktywna 2-minutowa przerwa. Test zostanie przeprowadzony 3 razy. WAnT ocenia maksymalną, minimalną i średnią moc, czas do osiągnięcia maksymalnej mocy oraz względny spadek mocy.

Próbki krwi będą pobierane podczas testów Wingate w dwóch punktach czasowych: interwencji PRE i POST, w tych samych warunkach. Próbki krwi z żyły ramienia zostaną pobrane przez wyspecjalizowaną pielęgniarkę do dwóch odpowiednich wystandaryzowanych probówek zawierających odpowiednio K2EDTA i aktywator krzepnięcia. Jednorazowo zostanie pobrane do 4 ml krwi. Próbki krwi będą pobierane pośrednio przed rozpoczęciem prób wysiłkowych, 30 minut po zakończeniu badań i 24 godziny po zakończeniu badań. Następnie krew zostanie odwirowana przy 3000 x g w celu oddzielenia surowicy i osocza. Materiał zostanie umieszczony w oddzielnie oznakowanych probówkach do mikrowirówki i przechowywany w temperaturze -80°C do późniejszych oznaczeń. Wszystkie analizy zostaną wykonane pod koniec studiów na Gdańskim Uniwersytecie Medycznym.

Pobrane próbki krwi żylnej zostaną poddane analizie w Gdańskim Uniwersytecie Medycznym. Naukowcy ocenią poziom cytokin prozapalnych (IL-6 i TNF-α) w surowicy oraz cytokin przeciwzapalnych (L-2 i IL-15) za pomocą dostępnych na rynku zestawów ELISA. Aby ocenić poziom uszkodzenia mięśni w osoczu, badacze określą aktywność kinazy kreatynowej (CK) metodą kinetyczną, wykorzystując dostępny w handlu zestaw.

Każdorazowo pobierane będą próbki krwi włośniczkowej, testy Wingate wykonywane są przez wyspecjalizowaną pielęgniarkę w ilości 100 µL do sterylnej mikrokapilary z podziałką. Pomiary zostaną wykonane z krwi włośniczkowej opuszki palca. Następnie krew zostanie przeniesiona do probówki do mikrowirówki zawierającej 500 µl 0,6 mola kwasu nadchlorowego, odwirowana i przechowywana w temperaturze -20 stopni C do czasu wykonania oznaczenia. Krew włośniczkowa zostanie pobrana przed próbą wysiłkową oraz po 2-3, 15, 30 i 60 minutach po próbie. Pobrane próbki krwi włośniczkowej zostaną poddane analizie w Gdańskim Uniwersytecie Medycznym. Celem analizy będzie określenie poziomu mleczanów w pobranych próbkach. Oznaczanie poziomu mleczanów zostanie przeprowadzone kolorymetryczną metodą kinetyczną, opartą na szybkości reakcji.

Badani dostarczą próbkę kału pośrednio przed i po okresie interwencji. Materiał zostanie zebrany przez uczestników do specjalnego ustandaryzowanego pojemnika. Próbka kału zostanie pobrana dwukrotnie: przed badaniem i po zakończeniu interwencji. Próbki kału zostaną natychmiast zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza, a następnie w tych samych warunkach przetransportowane do oceny przez niezależne laboratorium. Pobrane próbki kału zostaną poddane badaniu ilościowemu i jakościowemu składu mikroflory jelitowej metodą sekwencjonowania nowej generacji. Analizie poddane zostaną wybrane regiony hiperzmienne genu 16SrRNA. Skład mikrobiomu charakteryzować się będzie przede wszystkim różnorodnością alfa i beta. Różnorodność społeczności drobnoustrojów w jednej próbce (alfa) będzie mierzona za pomocą kilku wskaźników, takich jak Chao1, ACE, Shannon i odwrócony Simpson. Wszystkie wskaźniki będą wyliczane na podstawie surowych danych NGS (bez wstępnego przetwarzania np. usunięcie rzadkich gatunków) i porównanie między grupą badaną a grupą kontrolną przy użyciu standardowego testu statystycznego w zależności od rozkładu zmiennych. Różnorodność społeczności drobnoustrojów między próbkami (beta) będzie mierzona za pomocą wskaźnika różnicy (Bray-Curtis) i mierników odległości (ważony UniFrac - miernik oparty na filogenezie). Wskaźniki podobieństwa zostaną obliczone dla wszystkich par próbek i zapisane w macierzach odmienności. Bray-Curtis przeprowadzi permutacyjną wielowymiarową analizę wariancji (PERMANOVA) i ważone macierze różnic UniFrac, aby ocenić różnice na poziomie grupy. Analiza różnorodności beta zostanie poprzedzona nadzorowanym i nienadzorowanym wstępnym przetwarzaniem danych, takim jak usuwanie rzadkich gatunków i przekształcanie liczb z wykorzystaniem mediany głębokości sekwencjonowania jako czynnika skalującego. Pobrane próbki kału będą analizowane pod kątem obecności parametrów przepuszczalności jelit, takich jak kalprotektyna, zonulina i IFABP oraz produktów metabolizmu bakterii, takich jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA).

Wszystkie uzyskane dane zostaną przeanalizowane za pomocą programu statystycznego Statistica 13. Do analizy statystycznej zostaną włączone tylko pełne dane, od osób, które ukończyły cały okres interwencji oraz wszystkie procedury badawcze. Dane zostaną wcześniej sprawdzone pod kątem normalności za pomocą testu W Shapiro-Wilka. W przypadku danych o nienormalnym rozkładzie zostaną użyte ich logarytmy naturalne. Badacze będą zwykle korzystać ze statystyk opisowych w celu uzyskania informacji ogólnych, a także w celu zbadania trendów w analizowanych parametrach ze średnimi wartościami 95% przedziału ufności. W zależności od normalności danych bazowych zostaną przeprowadzone testy parametryczne lub nieparametryczne. Istotność statystyczną ustalono na p < 0,05.