Wpływ iniekcji domięśniowej mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny, jej kondycjonowanej pożywki i acetonidu triamcynolonu na stosunek kolagenu typu 1: 3 i poziomy interleukiny-10 w keloidzie: randomizowana, kontrolowana próba

Badanie przesiewowe pacjentów przeprowadzono poprzez pomiar wymiarów keloidu za pomocą linijki. Pacjenci spełniający kryteria włączenia zostali następnie losowo podzieleni na 3 grupy. Osobnikom podano taką samą objętość wstrzyknięcia (1 ml) na każdy cm3 objętości keloidu przy użyciu 1 ml strzykawki i igły 27G. Do wykonania wstrzyknięcia techniką in-plane do centrum zmiany pod kątem 30-45 stopni zastosowano kontrolę ultrasonograficzną, zapewniając równomierne ciśnienie u każdego pacjenta. Grupie 1 podano UC-MSC 2 miliony komórek/ml/cm3, grupie 2 UC-CM 1 ml/cm3, podczas gdy grupie 3 podano TA 40 mg/ml/cm3. W celu uzyskania UC-MSC i UC-CM pobrano 10 cm tkanki pępowinowej do 50 ml pożywki transportowej zawierającej następujące substancje: amfoterycynę B (stężenie końcowe 7500 ng/ml [JR Scientific 50701]), pożywkę alpha minimal essential (MEM [GIBCO 12000-022 1]), penicylina/streptomycyna (stężenie końcowe 300 U/ml [Gibco 15140-122]). Próbki następnie przetwarzano w ciągu 8 godzin od pobrania. Następnie pępowinę wycięto, krótko przemyto 0,5% powidonem-jodem (betadyna ©) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 (PBS [Sigma P3813]), a następnie przemyto w PBS w celu usunięcia betadyny i krwi. Naczynia pępowinowe wycięto przed zmieleniem pępowiny na kompletne podłoże. UC-CM utworzono przy użyciu Alpha-MEM i zmodyfikowanej przez Dulbecco pożywki Eagles (DMEM [GIBCO 31600-034]). Skończona pożywka kompletna zawiera 1% L-glutaminy (Lonza 17-605C), 10% TC (Indonezyjski Czerwony Krzyż), amfoterycynę B (końcowe stężenie 2500 ng/ml) i penicylinę/streptomycynę (końcowe stężenie 100 U/ml). Uzupełnienie hodowli 10% autologiczną lub allogeniczną surowicą krwi pępowinowej i 10% ludzką surowicą AB (Gibco 34005-100) wykonano w celu wytworzenia MEM. Każdą studzienkę 12-studzienkowej płytki (wzrost 3,8 cm2 [Biolite]) wypełniono trzema eksplantatami (średnica 2-5 mm) i galaretką Whartona, a następnie dodano kilka kropli kompletnej pożywki. Na każdej pożywce wykonano potrojenie hodowli. Płytkę inkubowano w 37°C i 5% CO2 i obserwowano codziennie pod kątem zanieczyszczenia lub wzrostu komórek, z których usunięto zanieczyszczone studzienki. Po przyczepieniu eksplantatów dodawano 200-500 µl odpowiedniej pożywki. Zmiany pożywek, polegające na usunięciu połowy pożywki i dodaniu połowy każdej pożywki, wykonywano co 2-3 dni. Wzrost komórek poza eksplantatami z 90% konfluencją oznacza żywotność do zbioru przy użyciu TrypLE Select (GIBCO 12563-011). Metodę wykluczenia barwnika zastosowano do zliczenia wydajności żywych/nieżywotnych komórek. Po każdym zbiorze, z eksplantem wciąż przyczepionym do płytki, dodawano nową odpowiednią pożywkę i ponownie inkubowano płytkę w 37°C i 5% CO2. Podobne traktowanie powtórzono dla drugiej i kolejnych kultur, umożliwiając wielokrotne zbiory z pojedynczego eksplantatu. Biopsje tkanek keloidowych przeprowadzono następnie dwukrotnie, podczas pierwszego spotkania i 17 tygodni później. Parametry, które należy ocenić w badaniu patologii anatomicznej to barwienie czerwienią Syriusza w celu oceny struktury kolagenu pod soczewką polaryzacyjną oraz badanie ilościowe In Vitro metodą ELISA w celu zbadania IL-10. Obliczenia zmian w stosunku poziomów kolagenu typu 1 do typu 3 przeprowadzono dzieląc stosunek kolagenu przed leczeniem od stosunku kolagenu po każdym zabiegu. Podczas wizualizacji pod soczewką polaryzacyjną kolagen typu 3 będzie wyglądał na zielony z dwójłomnością, a kolagen typu 1 z żółtym dwójłomnością. Stosunek kolagenu uzyskano przez podzielenie składu kolagenu typu 1 do kolagenu typu 3 w barwieniu czerwienią Syriusza pod soczewkami polaryzacyjnymi.