L'effetto dell'iniezione intralesiana di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale, il suo mezzo condizionato e il triamcinolone acetonide sul rapporto di collagene di tipo 1: 3 e sui livelli di interleuchina-10 nei cheloidi: uno studio controllato randomizzato

Lo screening dei pazienti è stato effettuato misurando le dimensioni dei cheloidi utilizzando un righello. I pazienti che soddisfacevano i criteri di inclusione sono stati quindi divisi casualmente in 3 gruppi. Lo stesso volume di iniezione (1 ml) in ogni cm3 di volume cheloideo è stato somministrato ai soggetti utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 27G. La guida ecografica è stata utilizzata per somministrare l'iniezione utilizzando una tecnica in-plane nel centro della lesione, con inclinazioni di 30-45 gradi, garantendo una pressione uniforme in ogni soggetto. Al gruppo 1 è stata somministrata UC-MSC 2 milioni di cellule/ml/cm3, al gruppo 2 è stata somministrata UC-CM 1 ml/cm3 mentre al gruppo 3 è stata somministrata TA 40 mg/ml/cm3. Per ottenere UC-MSC e UC-CM, 10 cm di tessuto del cordone ombelicale sono stati raccolti in 50 mL di mezzo di trasporto contenente le seguenti sostanze: amfotericina B (concentrazione finale 7500 ng/ml [JR Scientific 50701]), mezzo essenziale alfa minimo (MEM [GIBCO 12000-022 1]), penicillina/streptomicina (concentrazione finale 300 U/ml [Gibco 15140-122]). I campioni sono stati quindi processati entro 8 ore dalla raccolta. Il cordone ombelicale è stato quindi sezionato, lavato brevemente in povidone-iodio allo 0,5% (betadina ©) con soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4 (PBS [Sigma P3813]), e quindi lavato in PBS per rimuovere betadina e sangue. I vasi ombelicali sono stati asportati prima che il cordone ombelicale fosse tritato in un mezzo completo. UC-CM è stato creato utilizzando Alpha-MEM e il mezzo Eagles modificato di Dulbecco (DMEM [GIBCO 31600-034]). Il mezzo completo finalizzato contiene 1% L-glutammina (Lonza 17-605C), 10% TC (Croce Rossa Indonesiana), amfotericina B (concentrazione finale 2500 ng/ml) e penicillina/streptomicina (concentrazione finale 100 U/ml). L'integrazione della coltura con il 10% di siero di sangue del cordone ombelicale autologo o allogenico e il 10% di siero AB umano (Gibco 34005-100) è stata effettuata per creare MEM. Ciascun pozzetto di una piastra da 12 pozzetti (crescita di 3,8 cm2 [Biolite]) è stato riempito con tre espianti (diametro 2-5 mm) e gelatina di Wharton, seguita dall'aggiunta di diverse gocce di terreno completo. La triplicazione della coltura è stata eseguita su ciascun mezzo. La piastra è stata incubata a 37°C e 5% CO2 e osservata giornalmente per contaminazione o crescita cellulare, in cui i pozzetti contaminati sono stati rimossi. Dopo che gli espianti sono stati attaccati, è stata effettuata l'aggiunta di 200-500 µL di terreno appropriato. Ogni 2-3 giorni sono stati eseguiti cambi di terreno, che comportavano la rimozione di metà del terreno e l'aggiunta di metà di ciascun terreno. La crescita delle cellule oltre gli espianti con una confluenza del 90% segna la fattibilità per la raccolta utilizzando TrypLE Select (GIBCO 12563-011). Il metodo di esclusione del colorante è stato utilizzato per contare la resa cellulare vitale/non vitale. Dopo ogni raccolta, con l'espianto ancora attaccato alla piastra, è stato aggiunto un nuovo terreno appropriato con la piastra reincubata a 37°C e 5% CO2. Un trattamento simile è stato ripetuto per la seconda e le successive colture, consentendo raccolti multipli da un singolo espianto. Le biopsie dei tessuti cheloidi sono state quindi condotte due volte, nel primo incontro e 17 settimane dopo. I parametri da valutare nell'esame di anatomia patologica sono la colorazione con rosso Sirius per valutare la struttura del collagene sotto una lente polarizzante, nonché l'esame quantitativo in vitro utilizzando il metodo ELISA per esaminare IL-10. Il calcolo dei cambiamenti nel rapporto tra i livelli di collagene di tipo 1 e di tipo 3 è stato effettuato dividendo il rapporto di collagene prima del trattamento dal rapporto di collagene dopo ogni trattamento. Quando visualizzato sotto una lente polarizzante, il collagene di tipo 3 apparirà birifrangente verde e il collagene di tipo 1 apparirà birifrangente giallo. Il rapporto del collagene è stato ottenuto dividendo la composizione del collagene di tipo 1 in collagene di tipo 3 nella colorazione rosso Sirius sotto lenti polarizzanti.