Účinek intralesiánské injekce mezenchymálních kmenových buněk z pupečníku, jeho upraveného média a triamcinolonacetonidu na poměr kolagenu typu 1:3 a hladiny interleukinu-10 v keloidu: Randomizovaná kontrolovaná studie

Screening pacientů byl prováděn měřením keloidních rozměrů pomocí pravítka. Pacienti splňující kritéria pro zařazení byli poté náhodně rozděleni do 3 skupin. Subjektům byl podán stejný injekční objem (1 ml) v každém cm3 keloidního objemu pomocí 1 ml injekční stříkačky a 27G jehly. K aplikaci injekce pomocí techniky in-plane do středu léze se sklonem 30-45 stupňů bylo použito ultrazvukové navádění, což zajišťuje rovnoměrný tlak u každého subjektu. Skupině 1 byl podáván UC-MSC 2 miliony buněk/ml/cm3, skupině 2 byl podáván UC-CM 1 ml/cm3, zatímco skupině 3 byl podáván TA 40 mg/ml/cm3. Za účelem získání UC-MSC a UC-CM bylo odebráno 10 cm tkáně pupečníku do 50 ml transportního média obsahujícího následující látky: amfotericin B (konečná koncentrace 7500 ng/ml [JR Scientific 50701]), minimální esenciální médium alfa (MEM [GIBCO 12000-022 1]), penicilin/streptomycin (konečná koncentrace 300 U/ml [Gibco 15140-122]). Vzorky byly poté zpracovány do 8 hodin od odběru. Pupeční šňůra byla poté vypreparována, krátce promyta v 0,5% povidon-jodu (betadin ©) fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem o pH 7,4 (PBS [Sigma P3813]) a poté promyta v PBS k odstranění betadinu a krve. Pupečníkové cévy byly vyříznuty předtím, než byla pupeční šňůra rozsekána na kompletní médium. UC-CM byl vytvořen pomocí Alpha-MEM a Dulbeccova modifikovaného Eagles média (DMEM [GIBCO 31600-034]). Finalizované kompletní médium obsahuje 1% L-glutamin (Lonza 17-605C), 10% TC (Indonéský červený kříž), amfotericin B (konečná koncentrace 2500 ng/ml) a penicilin/streptomycin (konečná koncentrace 100 U/ml). Pro vytvoření MEM byla provedena suplementace kultury 10% autologním nebo alogenním sérem z pupečníkové krve a 10% lidským AB sérem (Gibco 34005-100). Každá jamka 12jamkové destičky (růst 3,8 cm2 [Biolite]) byla naplněna třemi explantáty (průměr 2-5 mm) a Wharton's Jelly, následovalo přidání několika kapek kompletního média. Pro každé médium byla provedena triplikace kultury. Destička byla inkubována při 37 °C a 5 % CO2 a denně pozorována na kontaminaci nebo buněčný růst, ve kterých byly kontaminované jamky odstraněny. Po připojení explantátů bylo přidáno 200-500 ul vhodného média. Změny média, zahrnující odstranění poloviny média a přidání poloviny každého média, byly prováděny každé 2-3 dny. Růst buněk za explantáty s 90% konfluencí označuje životaschopnost pro sklizeň pomocí TrypLE Select (GIBCO 12563-011). K počítání výtěžku životaschopných/neživotaschopných buněk byla použita metoda vylučování barviva. Po každé sklizni, s explantátem stále připojeným k plotně, bylo přidáno nové vhodné médium a plotna byla znovu inkubována při 37 °C a 5 % C02. Podobné ošetření bylo opakováno pro druhou a další kultury, což umožnilo vícenásobné sklizně z jednoho explantátu. Biopsie keloidních tkání byly poté provedeny dvakrát, na prvním setkání a 17 týdnů poté. Parametry, které mají být hodnoceny při anatomickém patologickém vyšetření, jsou barvení Siriusovou červení pro hodnocení struktury kolagenu pod polarizační čočkou, stejně jako kvantitativní vyšetření In Vitro pomocí metody ELISA pro vyšetření IL-10. Výpočet změn v poměru hladin kolagenu typu 1 k typu 3 byl proveden vydělením poměru kolagenu před ošetřením od poměru kolagenu po každém ošetření. Při vizualizaci pod polarizační čočkou se bude kolagen typu 3 jevit jako zelený dvojlom a kolagen typu 1 jako žlutý dvojlom. Poměr kolagenu byl získán rozdělením složení kolagenu typu 1 ke kolagenu typu 3 v barvení Sirius red pod polarizačními čočkami.