Влияние внутрилезийной инъекции мезенхимальных стволовых клеток пуповины, ее кондиционированной среды и триамцинолона ацетонида на соотношение коллагена типа 1:3 и уровни интерлейкина-10 в келоидах: рандомизированное контролируемое исследование

Скрининг пациентов проводили путем измерения размеров келоида с помощью линейки. Затем пациенты, отвечающие критериям включения, были случайным образом разделены на 3 группы. Один и тот же объем инъекции (1 мл) на каждый см3 объема келоида вводили испытуемым с помощью шприца на 1 мл и иглы 27G. Инъекцию вводили под ультразвуковым контролем плоскостно в центр поражения с наклоном 30-45 градусов, обеспечивая равномерное давление у каждого субъекта. Группе 1 вводили UC-MSC 2 миллиона клеток/мл/см3, группе 2 вводили UC-CM 1 мл/см3, а группе 3 вводили ТА 40 мг/мл/см3. Для получения UC-MSC и UC-CM 10 см ткани пуповины собирали в 50 мл транспортной среды, содержащей следующие вещества: амфотерицин B (конечная концентрация 7500 нг/мл [JR Scientific 50701]), альфа-минимальная основная среда (MEM [GIBCO 12000-022 1]), пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация 300 ЕД/мл [Gibco 15140-122]). Затем образцы обрабатывали в течение 8 часов после сбора. Затем отсекали пуповину, быстро промывали 0,5% раствором повидон-йода (бетадин ©) с фосфатно-солевым буфером с рН 7,4 (PBS [Sigma P3813]), а затем промывали в PBS для удаления бетадина и крови. Сосуды пуповины вырезали до измельчения пуповины до полной среды. UC-CM создавали с использованием Alpha-MEM и модифицированной Дульбекко среды Иглса (DMEM [GIBCO 31600-034]). Готовая полная среда содержит 1% L-глутамина (Lonza 17-605C), 10% ТС (Индонезийский Красный Крест), амфотерицин В (конечная концентрация 2500 нг/мл) и пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация 100 ЕД/мл). Дополнение культуры 10% аутологичной или аллогенной сывороткой пуповинной крови и 10% сывороткой AB человека (Gibco 34005-100) было сделано для создания MEM. Каждую лунку 12-луночного планшета (рост 3,8 см2 [Biolite]) заполняли тремя эксплантами (диаметром 2-5 мм) и Wharton's Jelly с последующим добавлением нескольких капель полной среды. На каждой среде проводили трехкратное посевы. Планшет инкубировали при 37°C и 5% CO2 и ежедневно наблюдали за контаминацией или ростом клеток, при этом загрязненные лунки удаляли. После прикрепления эксплантатов добавляли 200-500 мкл соответствующей среды. Смену среды, включающую удаление половины среды и добавление половины каждой среды, проводили каждые 2-3 дня. Рост клеток за пределами эксплантов с 90% слиянием свидетельствует о жизнеспособности для сбора с использованием TrypLE Select (GIBCO 12563-011). Метод исключения красителя использовали для подсчета выхода жизнеспособных/нежизнеспособных клеток. После каждого сбора, когда эксплантат все еще был прикреплен к чашке, добавляли новую подходящую среду с повторной инкубацией чашки при 37°C и 5% CO2. Аналогичную обработку повторяли для второй и последующих культур, что позволяло получить несколько урожаев с одного эксплантата. Биопсия келоидных тканей была затем проведена дважды, во время первой встречи и через 17 недель после нее. Параметры, подлежащие оценке при патологоанатомическом исследовании, включают окрашивание сириусом красным для оценки структуры коллагена под поляризующей линзой, а также количественное исследование in vitro с использованием метода ELISA для определения IL-10. Расчет изменения соотношения уровней коллагена 1-го и 3-го типа проводили путем деления соотношения коллагена до лечения на соотношение коллагена после каждого лечения. При визуализации под поляризационной линзой коллаген типа 3 будет иметь зеленое двойное лучепреломление, а коллаген типа 1 будет иметь желтое двойное лучепреломление. Соотношение коллагена было получено путем деления состава коллагена типа 1 на коллаген типа 3 при окрашивании сириусом красным под поляризующими линзами.