Dieta naśladująca post i zapalenie przyzębia (FMD) (FMD)

Wstęp

Zapalenie przyzębia jest chorobą zapalną przyzębia o podłożu mikrobiologicznym. Wykazano, że stan zapalny związany z zapaleniem przyzębia nie ogranicza się do przyzębia, ale może mieć daleko idące konsekwencje w całym organizmie, a częściowo może to wynikać z ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się mikroorganizmów jamy ustnej. Etapy 1 i 2 leczenia periodontologicznego wiążą się także z krótkotrwałą reakcją zapalną ostrej fazy, charakteryzującą się podwyższeniem poziomu krążących markerów ostrej fazy stanu zapalnego, co z kolei, w przypadku powodzenia, powoduje długoterminową redukcję tych cząsteczek. W perspektywie średnio- i długoterminowej towarzyszą temu zmiany w innych markerach stanu naczyń obwodowych wraz z poprawą kontroli metabolicznej trwającą co najmniej 12 miesięcy. Wiadomo, że zapalenie przyzębia ma dwukierunkowy związek z zaburzeniami i rozregulowaniem metabolizmu. Niedawne prace potwierdziły, że zapalenie przyzębia jest powiązane z ogólnoustrojowym stanem zapalnym mierzonym na podstawie poziomu białka C-reaktywnego (CRP) w surowicy. Ponadto donoszono, że intensywne niechirurgiczne leczenie zapalenia przyzębia (etapy 1 i 2) prowadziło do stopniowego zmniejszenia poziomu CRP po 90 dniach z umiarkowanym wzrostem po 180 dniach. Uważa się, że poprawa kontroli metabolicznej może również poprawić wyniki leczenia przyzębia, jednak dokładne mechanizmy tego nie są w pełni jasne. Opublikowano także kilka badań na ludziach i eksperymentów dotyczących możliwego wpływu odżywiania na leczenie zapalenia przyzębia. Badanie na małpach wykazało, że długotrwałe ograniczenie kalorii w diecie (dieta wzbogacona w witaminy i minerały) łagodzi kliniczny stan zapalny i zmniejsza stopień uszkodzenia przyzębia w wyniku ostrej ekspozycji drobnoustrojów. Jednakże w innym badaniu eksperymentalnym na małpach długoterminowa dieta hipokaloryczna (30% mniej dziennego spożycia kalorii oraz witaminy i minerały) okazała się w różnym stopniu zmniejszać wytwarzanie lokalnych mediatorów stanu zapalnego i ryzyko zapalnej choroby przyzębia u mężczyzn, ale nie u kobiet. Ponadto niedawny przegląd systematyczny na modelach zwierzęcych wykazał, że makroskładniki odżywcze wpływające na stres oksydacyjny lub układ odpornościowy (tj. kwasy tłuszczowe n-3) wydają się być ważne w zapobieganiu lub leczeniu zapalenia przyzębia. Jeśli chodzi o badania na ludziach, koreańska grupa po czterotygodniowej interwencji polegającej na kontrolowaniu masy ciała u otyłych osób zdrowych przyzębia zaobserwowała zmniejszenie poziomu metaloproteinazy macierzy (MMP)-8, MMP-9 i interleukiny-1β (IL-1β) w płyn dziąsłowy (GCF). Niemiecki zespół stwierdził, że dieta składająca się z niskiego spożycia węglowodanów, bogatego w kwasy tłuszczowe Omega 3 i błonnik, wyższych wartości witamin C i D, redukcji białka zwierzęcego i ukierunkowanego spożycia roślin zawierających azotany może prowadzić do znacznego zmniejszenia zapalenie przyzębia i dziąseł, chociaż serologiczne parametry stanu zapalnego i mikrobiom poddziąsłowy wydają się niezmienione. Niedawno przeprowadzone badanie wykazało, że nie ma ogólnego związku pomiędzy zachodnimi wzorcami żywieniowymi (charakteryzującymi się większym spożyciem przetworzonego mięsa, czerwonego mięsa, masła, wysokotłuszczowych produktów mlecznych, jaj i rafinowanych zbóż) a ostrożnymi wzorcami żywieniowymi (charakteryzującymi się większe spożycie warzyw, owoców, roślin strączkowych, produktów pełnoziarnistych, ryb i drobiu) oraz zapalenie przyzębia; Jednak gdy wzięto pod uwagę wyłącznie osoby otyłe, dieta zachodnia była powiązana z wyższym ryzykiem zapalenia przyzębia. Inne, bardzo niedawne badanie, oparte na zastosowaniu dietetycznego wskaźnika stanu zapalnego, wykazało, że stosowanie diety prozapalnej było powiązane z umiarkowanie ciężkim zapaleniem przyzębia w ogólnej populacji dorosłych w USA. Aby zwiększyć przestrzeganie zaleceń przez pacjentów, wprowadzono nowatorski sposób postu, który wynika z faktu, że ludzie zwykle nie są w stanie przez dłuższy czas przestrzegać rygorystycznej diety. W szczególności dieta naśladująca post (FMD), składająca się z 30–50% normalnego spożycia kalorii przez 4–7 kolejnych dni, a następnie raz w miesiącu dokarmiana do woli, wykazała bardzo obiecujące korzystne skutki w postaci zmniejszenia ryzyka czynniki starzenia, cukrzycy, chorób autoimmunologicznych, chorób układu krążenia, neurodegeneracji i nowotworów. Ogólnie rzecz biorąc, nadal nie ma pewności co do potencjalnego wpływu okresowego głodzenia na parametry kliniczne i zapalne przyzębia. Według naszej wiedzy w żadnym badaniu nie oceniano potencjalnego wpływu FMD na odpowiedź ogólnoustrojową i przyzębia po leczeniu zapalenia przyzębia.

Cele

Głównym celem tego badania jest sprawdzenie, czy dieta naśladująca post może wpływać na reakcję ogólnoustrojową i przyzębia po niechirurgicznym leczeniu przyzębia. Hipotezą zerową jest to, że dieta naśladująca post nie modyfikuje miejscowej i ogólnoustrojowej reakcji zapalnej po leczeniu.

Projekt badania

Jest to wieloośrodkowe, randomizowane badanie kliniczne z podwójnie ślepą próbą (ocena wyników i statystyk), z udziałem równoległych grup i proporcji 1:1, z wewnętrznym pilotem. Wszyscy zarekrutowani pacjenci otrzymają ten sam protokół leczenia periodontologicznego (etapy 1 i 2). Jedna grupa (test) zostanie poddana trzem cyklom pryszczycy. Program FMD to program diety roślinnej, mający na celu osiągnięcie efektów postu, przy jednoczesnym zapewnieniu zarówno makro-, jak i mikroelementów, aby zminimalizować ciężar postu i jego niekorzystne skutki. FMD składa się w 100% ze składników powszechnie uznawanych za bezpieczne (GRAS) i obejmuje autorskie zupy na bazie warzyw, batony energetyczne, napoje energetyczne, przekąski krakersowe, oliwki, herbaty ziołowe i suplementy. Wszystkie produkty do spożycia dziennie są pakowane indywidualnie, aby umożliwić badanym wybór, kiedy zjeść, jednocześnie unikając przypadkowego spożycia składników następnego dnia. FMD składa się z 5-dniowego schematu, który dostarcza około 1100 kilokalorii w pierwszym dniu; około 750 kilokalorii dziennie przez drugi do piątego dnia. Wręcz przeciwnie, druga grupa (kontrolna) będzie kontynuować swoją normalną dietę.

Wybór tematu

Jest to badanie wieloośrodkowe. Uczestnicy zostaną poddani badaniu przesiewowemu przez Międzynarodowy Uniwersytet w Katalonii (UIC), Uniwersytet Complutense w Madrycie (UCM), Uniwersytet w Santiago de Compostela, Uniwersytet w Murcji i studentów Uniwersytetu w Granadzie wśród pacjentów z zapaleniem przyzębia przebywających w odpowiednich szpitalach. Badacze spodziewają się, że rocznie będzie dostępnych 24 kwalifikujących się uczestników i zakładają, że 70% z nich zgodzi się na udział w badaniu po wyrażeniu wstępnego zainteresowania.

Procedury badawcze

Rekrutacja przedmiotowa

Do pacjentów uniwersytetów Międzynarodowego Uniwersytetu w Katalonii, Uniwersytetu Complutense, Santiago de Compostela i Uniwersytetu w Granadzie podchodzi się indywidualnie w sprawie rekrutacji na terenie kampusu i na wydziale stomatologicznym. Po wyrażeniu wstępnego zainteresowania potencjalni uczestnicy otrzymają arkusz informacyjny i będą mieli możliwość zadawania pytań członkom zespołu badawczego za pośrednictwem poczty elektronicznej lub telefonu. Jeśli wówczas wyrażą chęć udziału, zostaną zaproszeni na wizytę projekcyjną. Każda osoba będzie miała co najmniej 24 godziny, a maksymalnie tydzień, na podjęcie decyzji, czy chce wziąć udział. Po ukończeniu badania poszczególne osoby otrzymają zwrot kosztów za poświęcony czas.

Procedury przesiewowe

Podczas wizyty przesiewowej przeszkolony wnioskodawca lub dentysta prowadzący badanie poprosi o zgodę, która zostanie odnotowana w formie pisemnego formularza zgody uczestnika zawierającego szczegółowo całą procedurę badania oraz listę kontrolną zgody dla każdej metody gromadzenia danych. Po wyrażeniu zgody każdy zarejestrowany uczestnik zostanie zarejestrowany w formularzu Dziennika Uczestnika. Wstępna kontrola przesiewowa będzie miała na celu upewnienie się, że każda osoba spełnia określone kryteria włączenia i wykluczenia. Zostanie to ocenione na podstawie wywiadu ustnego i zapisane w papierowym formularzu dziennika badań przesiewowych. Uczestnicy będą musieli przejść badanie periodontologiczne przeprowadzane przez dentystę prowadzącego badanie, aby upewnić się, że kwalifikują się do udziału w badaniu.

Procedury randomizacji i ukrywanie alokacji

Początkowa randomizacja centralna zostanie przeprowadzona przy użyciu metody „zapieczętowanej koperty” przez personel niezaangażowany bezpośrednio w badanie, w szpitalu Guy's. W przypadku ważnych czynników wpływających („centrum”) przeprowadzona zostanie randomizacja warstwowa zgodnie z zaleceniami. Nie zostanie przeprowadzona stratyfikacja ze względu na wiek, ponieważ w przypadku małych próbek stratyfikacja powinna ograniczać się do jednego lub bardzo kilku czynników, a wpływ wieku jest ograniczony przez projekt badania i zostanie uwzględniony w analizach statystycznych. W każdym ośrodku pacjenci zostaną przydzieleni do jednej z dwóch grup terapeutycznych przy użyciu listy randomizacyjnej przygotowanej wcześniej przez statystyka badania. Lista zostanie wygenerowana poprzez zablokowaną randomizację. W każdym ośrodku będzie używana zapieczętowana koperta, aby zapewnić ukrycie przydziału. Uczestnik zostanie przydzielony na zabieg testowy lub kontrolny w okresie od -7/-10 do dnia 0. Terapeuta zostanie poinformowany o przydzieleniu leczenia poprzez otwarcie koperty na początku wizyty terapeutycznej.

Harmonogram każdej wizyty

Uczestnicy, którzy wyrazili zainteresowanie udziałem w bezpośrednich dyskusjach lub odpowiedziach na reklamy, zostaną zaproszeni na wizytę projekcyjną. Odbędzie się to, podobnie jak wszystkie wizyty studyjne, w Hospital General de Catalunya (Barcelona) oraz na oddziałach odontostomatologii (Clinica de Odontologia) w Madrycie, Santiago de Compostela, Murcji i Granadzie i powinno zająć około 45 minut. Odbędzie się to w dogodnym dla obu stron terminie i terminie dla potencjalnego uczestnika badania i lekarza dentysty, w ramach dostępności przestrzeni klinicznej. Tutaj zostaną początkowo zapytani o dane osobowe/historię medyczną i przejdą badanie stomatologiczne. Jeśli się zakwalifikują, zostaną poinformowani o rozpoczęciu kolejnego etapu badania i po wyznaczeniu terminu spotkania w celu rozpoczęcia badania. Leczenie prowadzić będą studenci studiów podyplomowych magisterskich z periodontologii każdego ośrodka.

Jeden-dwa tygodnie później, w dniu -7/-10 (wizyta wyjściowa lub wizyta 1), zostanie wyrażona i podpisana świadoma zgoda. Zostaną pobrane próbki krwi, GCF, płytki nazębnej i kału. Zostanie sprawdzona historia choroby, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, a także zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej obejmujące liczbę zębów i w 6 miejscach na głębokość sondowania zęba, recesję (mm) i krwawienie po sondowaniu. Przewidziana zostanie bardzo powierzchowna profilaktyka, motywacja i instruktaż higieny jamy ustnej.

W Dniu 0 (rano) (wizyta 2) pacjenci przydzieleni do grupy testowej rozpoczną leczenie FMD przez 5 kolejnych dni. Wszyscy pacjenci zostaną poddani zabiegom z użyciem instrumentacji poddziąsłowej pełnej jamy ustnej (PMPR) i zostaną wzmocnione bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące higieny. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, a także zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań. Przeszkolony, zarejestrowany dietetyk (z jednego z ośrodków) omówi z pacjentami pryszczycę, a także przekaże ankietę zawierającą raporty dotyczące niezjedzonych i spożytych dodatkowych produktów spożywczych.

W dniu 1 (v3) zostaną pobrane próbki krwi i GCF. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań.

W dniu 7 (v4) zostaną pobrane próbki krwi i GCF. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań.

W dniu 45±5 (v5) zostaną pobrane próbki krwi i GCF. Zostanie wzmocniony instruktaż higieny jamy ustnej oraz przeprowadzona zostanie sesja skalingu naddziąsłowego z polerowaniem. U pacjentów z grupy badanej zostanie rozpoczęty drugi cykl FMD. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań.

W 85. ±5. dniu (v6) u pacjentów z grupy testowej rozpocznie się trzeci cykl FMD. Zostaną sprawdzone wywiady, działania niepożądane i stosowane jednocześnie leki, wzmocnione zostaną zalecenia dotyczące higieny jamy ustnej oraz przeprowadzona zostanie sesja skalingu naddziąsłowego z polerowaniem.

W dniu 90 ± 5 (v7) zostaną zapisane pomiary w formie karty przyzębia całej jamy ustnej. Zostaną pobrane próbki krwi i próbki GCF. Zostaną wzmocnione instruktaże higieny jamy ustnej i, jeśli zajdzie taka potrzeba, przeprowadzona zostanie sesja wspomagającego leczenia periodontologicznego. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań.

W dniu 180 ± 10 (v8) zostaną zapisane pomiary przyzębia całej jamy ustnej w 6 miejscach na każdy ząb: głębokość sondowania, recesja (mm) i krwawienie po sondowaniu. Zostaną pobrane próbki krwi, GCF, płytki nazębnej i kału. Wzmocnione zostaną instrukcje dotyczące higieny jamy ustnej. Zostaną sprawdzone wywiady, zdarzenia niepożądane i stosowane jednocześnie leki, zostanie przeprowadzone badanie jamy ustnej w celu wykrycia powikłań.

*Pacjenci będą dzwonieni jeden lub dwa razy podczas każdego cyklu FMD, aby sprawdzić, czy wszystko przebiega prawidłowo i rozwiązać wszelkie problemy lub wątpliwości, jakie mogą mieć.

Dalsze procedury

Jeżeli uczestnik opuści wiele (2/3) wizyt, można to uznać za rezygnację z udziału w programie. Zostaną one jednak uwzględnione w analizie zamiaru leczenia.

Definicja zakończenia badania

Badanie zostanie zakończone, gdy wszyscy uczestnicy przejdą wszystkie fazy okresu klinicznego i zostaną przeprowadzone przetwarzanie/analiza materiału biologicznego i wyników klinicznych.

Pobieranie próbek/oznaczanie/rejestrowanie

Próbki zostaną pobrane od pacjenta podczas wizyty studyjnej przez wykwalifikowanych dentystów Międzynarodowego Uniwersytetu w Katalonii, Uniwersytetu Complutense w Madrycie, Uniwersytetu w Santiago de Compostela, Uniwersytetu w Murcji i Uniwersytetu w Granadzie, którzy wezmą udział w tym badaniu. Podczas pobierania wszystkich rodzajów próbek należy przestrzegać zasad higieny rąk, dopasowanych rękawiczek i sterylnych przedmiotów do badania jednorazowego użytku, aby zapewnić integralność pobranych próbek oraz bezpieczeństwo osoby badającej i uczestnika. Przed każdą wizytą przygotowywane będą probówki z pseudoanonimowymi etykietami, których etykieta będzie składać się z numeru uczestnika poprzedzonego oznaczeniem typu próbki, np. G dla GCF, B dla krwi, S dla śliny, SubP dla płytki nazębnej poddziąsłowej itp. Pobieranie próbek będzie odbywać się podczas każdej wizyty przed badaniem klinicznym, aby zapobiec uszkodzeniu miejsca pobrania próbki lub lekkiemu uszkodzeniu dziąseł podczas manipulacji fizycznej krwawienie, które może skazić pobieraną próbkę. Paski GCF Periopaper® (Pro-flow Inc., Amityville, Nowy Jork, USA) zostaną umieszczone w szczelinie dziąsłowej zębów w najgłębszym miejscu kieszeni (od strony policzkowej) w każdym kwadrancie. Następnie zostaną one natychmiast zmierzone za pomocą skalibrowanego przetwornika elektronicznego Periotron 8000 (Pro-Flow Inc., Amityville, Nowy Jork, USA), który określi ilościowo ilość zebranego GCF. Po dokonaniu pomiaru paski GCF przeznaczone na tę wizytę będą przechowywane w temperaturze -80°C w pojedynczej probówce o pojemności 2 ml i gromadzone w celu dalszej analizy. Z ramienia uczestnika zostanie pobrane 4 ml krwi żylnej do sterylnych próżniowych pojemników próżniowych Hemogard z bezpiecznym zamknięciem, zawierających antykoagulant K2, sól potasową EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego), który został naniesiony natryskowo na wewnętrzną powierzchnię probówki. Próbki będą pobierane przez doświadczonych i przeszkolonych flebotomistów. Aby zmniejszyć ryzyko omdlenia, uczestnicy będą znajdować się na cokole w pozycji półleżącej przez cały czas pobierania próbek i przez pięć minut po pobraniu próbki. Badacz będzie obecny przy uczestniku przez cały czas, aby upewnić się, że w przypadku omdlenia nie dojdzie do upadku ani obrażeń. Zużyte igły zostaną wyrzucone do bezpiecznego pojemnika na ostre przedmioty. Próbki surowicy będą wirowane przez 10 minut przy 11 000 obr./min, a następnie natychmiast podzielone na porcje o pojemności 0,2–0,5 ml i przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu konieczności analizy. Próbki płytki nazębnej poddziąsłowej będą pobierane z powierzchni policzkowej zęba przez dentystę przeprowadzającego badanie przy użyciu sterylnej łyżeczki, odpowiednio poniżej brzegu dziąsła. Podczas każdej wizyty studyjnej płytka nazębna będzie pobierana z zębów znajdujących się w najgłębszej kieszonce (powierzchnia policzkowa). Zęby te wybrano tak, aby miały dobrą mieszankę zębów trzonowych i siekaczy. Zebrana płytka nazębna z tych czterech zębów zostanie połączona z 1 ml sterylnego 0,1x Tris-EDTA i przechowywana w temperaturze -80°C. Uczestnicy otrzymają zestawy do domowego pobierania próbek kału w roztworze konserwującym ([http://www.microbiome-standards.org)] http://www.mikrobiom- standardy.org) a próbka ta zostanie wysłana do lokalnego laboratorium w ciągu 7 dni od pobrania. Po otrzymaniu próbek kału do laboratorium będą one przechowywane w temperaturze -80°C. Wszystkie biologicznie skażone artykuły jednorazowego użytku zostaną wyrzucone do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne w celu przetworzenia i usunięcia. Wszystkie pobrane próbki zostaną zapisane w drukowanym CRF uczestnika podczas tej wizyty badawczej, z zarejestrowaną datą i godziną pobrania oraz inicjałami dentysty pobierającego badanie. Zostanie to również zapisane w arkuszu kalkulacyjnym Excel. Jeżeli podczas tej wizyty nie będzie możliwe pobranie określonej próbki, przyczyna tego zostanie podana w odpowiedniej sekcji „Dodatkowe uwagi” CRF.

Procedury analizy próbek

Wszystkie eksperymenty będą prowadzone w laboratoriach Mikrobiomu i Śliny w Guy's Hospital. Próbki GCF zostaną rozmrożone i eluowane w PBS (pH 7,2 ± 0,2) uzupełnionym koktajlem inhibitora proteazy Easypack (Roche), jak opisano w Curtis i in. 1988. W skrócie, paski periopapieru zostaną umieszczone w perforowanej probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, która będzie trzymana wewnątrz probówki o pojemności 1,5 ml. Bufor do elucji (50 μl) zostanie dodany do pasków i umieszczony w wytrząsarce wirowej na 2 minuty przed wirowaniem przez 15 minut przy 11 000 obr./min. i w temperaturze 4 ̊C. Wirowanie zostanie powtórzone, dodając do pasków kolejne 50 µl buforu do elucji, aby uzyskać ~90 µl całkowitego wymytego GCF. Stężenie białka będzie oznaczane ilościowo przy użyciu płytki LVis (BMG Labtech CLARIOstar) skalibrowanej albuminą surowicy bydlęcej (Sigma). Analizę GCF dla wybranych analitów przeprowadzi firma Luminex. Próbki zostaną przetworzone w Centrum Interakcji Gospodarz-Mikrobiom KCL, fl.17 Guys Tower Wing. Próbki płytki nazębnej i kału zostaną poddane ekstrakcji DNA zgodnie ze standardowymi procedurami w naszym laboratorium i zostaną przeanalizowane przy użyciu sekwencjonowania DNA nowej generacji w celu scharakteryzowania mikroflory poddziąsłowej w celu zidentyfikowania i określenia poziomów kluczowych bakteryjnych patogenów przyzębia oraz zmian obejmujących całą społeczność drobnoustrojów w leczonych miejscach zarówno z protokołami testowymi, jak i kontrolnymi. Próbki krwi zostaną zbadane pod kątem cytokin, białek ostrej fazy i markerów stanu zapalnego przy użyciu różnych technik, takich jak Western blot lub testy immunoenzymatyczne (ELISA), które pozwolą określić obecność i ilość tych cytokin we krwi. Płyn dziąsłowy będzie analizowany pod kątem mediatorów stanu zapalnego, przeciwciał, peptydów i cytokin, ponownie przy użyciu technik takich jak ELISA. W celu monitorowania zgodności z FMD oceniany będzie poziom krążącego IGF-1, poziom glukozy we krwi na czczo, poziom β-hydroksymaślanu we krwi.

ELISA (wysokoczuły dwumiejscowy test immunoenzymatyczny): wykrywanie IL-6.

Cobas Integra 700 (automatyczny test immunoturbidymetryczny o wysokiej czułości): wykrywanie HsCRP.

Dane wygenerowane w wyniku tych eksperymentów będą przechowywane na bezpiecznych, chronionych hasłem komputerach firmy King's, w tym na komputerach w laboratoriach Salivary i Microbiome oraz na laptopie badawczym dostarczonym przez firmę King's.

Procedury przechowywania próbek

Próbki krwi, śliny, płytki nazębnej i GCF będą przechowywane w temperaturze -80°C w bezpiecznych, zamykanych zamrażarkach HTA w laboratoriach Międzynarodowego Uniwersytetu w Katalonii, Uniwersytetu Complutense w Madrycie, Uniwersytetu w Santiago de Compostela i Uniwersytetu w Granadzie. Zapewni to długoterminową stabilność gotowości do przetwarzania próbki. Po pobraniu próbki kału zostaną przesłane przez pacjentów do każdego uczestniczącego ośrodka w zapieczętowanych, ostemplowanych kopertach. Podczas przechowywania wszystkie próbki zostaną sprawdzone pod kątem ich integralności fizycznej, a próbki przeznaczone do zamrożenia zostaną następnie zapisane w chronionej hasłem, bezpiecznej komputerowej bazie danych, która rejestruje ich lokalizację w zamrażarce oraz godzinę/datę ich przechowywania. Fizyczna wersja papierowa zawierająca przechowywane próbki będzie również uwzględniona w CRF. Przechowywanie, transport, wykorzystanie i ostateczna utylizacja dostarczonej próbki będą prowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o tkankach ludzkich z 2004 r. oraz z dyrektywami UE dotyczącymi tkanek i komórek. Jeśli jakiekolwiek próbki nie zostaną natychmiast przetworzone, zostaną pseudoanonimowo zapisane do dalszej analizy w późniejszym terminie. Próbki zostaną przekazane do laboratorium Salivary w Guy's Hospital i będą archiwizowane przez 10 lat po zakończeniu. Po wygaśnięciu zgody na badanie ze względów etycznych próbki krwi, śliny i GCF zostaną usunięte zgodnie z ustawą Human Tissue Act 2004 wraz ze wszystkimi zmianami lub przekazane do banku tkanek.

Wysyłka próbki z Hiszpanii do Wielkiej Brytanii

Próbki zostaną umieszczone w igloo, które może zawierać wystarczającą ilość lodu/suchego lodu, aby zapewnić przechowywanie próbek w odpowiedniej temperaturze dłużej niż szacowany czas podróży. Następnie styropianowe igloo jest częściowo wypełniane lodem/suchym lodem, zapewniając miejsce na próbki i dodatkowy lód. Próbki można umieścić w szczelnie zamkniętej torbie plastikowej, aby ułatwić katalogowanie. Następnie igloo napełnia się suchym lodem w celu przykrycia próbek, dołączono formularz wysyłkowy oraz dodatkowo kopię etykiety adresowej w zapieczętowanej plastikowej torbie na próbki. Na igloo zostanie założona pokrywa i zabezpieczona taśmą pakową. Następnie igloo jest pakowane w mocny brązowy papier do pakowania, a przed dostawą dołączana jest zarówno etykieta adresowa, jak i etykiety ostrzegające o zagrożeniu w bardzo niskich temperaturach. Wybrany zostanie najszybszy środek transportu (np. samolot), tak aby wysyłka mogła zostać zrealizowana możliwie najszybciej.

Ocena bezpieczeństwa

Badacze nie przewidują żadnego znaczącego ryzyka dla uczestnika zaangażowanego w pobieranie próbek, w tym próbek krwi, ponieważ są to procedury ugruntowane. Na podstawie wcześniejszej literatury potencjalne ryzyko może dotyczyć łagodnych/umiarkowanych ogólnoustrojowych działań niepożądanych spowodowanych dietą FMD, w tym zmęczenia, osłabienia i bólów głowy. Istnieje również niewielkie ryzyko omdlenia podczas pobierania krwi lub po nim. Aby zmniejszyć to ryzyko, uczestnicy będą znajdować się na cokole częściowo odchylonym przez cały czas pobierania próbek i przez pięć minut po pobraniu próbki. Badacz będzie obecny przy uczestniku przez cały czas, aby upewnić się, że w przypadku omdlenia nie dojdzie do upadku ani obrażeń. Jeżeli podczas pobierania próbki krwi badający ukłuje się igłą lub nastąpi zadrapanie, zostaną wdrożone lokalne procedury reagowania na takie zdarzenia. Nie oczekuje się wystąpienia żadnych poważnych zdarzeń niepożądanych w trakcie badania.

Raportowanie etyczne

Zdarzenie niepożądane to wszelkie niekorzystne i niezamierzone oznaki, objawy lub choroba związana z badaniem. Jeżeli wystąpi Zdarzenie Niepożądane, takie jak omdlenie podczas pobierania krwi, badacz poinformuje o tym Głównego Badacza w celu włączenia go do dokumentacji badania CRF. Poważne zdarzenie niepożądane (SAE) to zdarzenie, które powoduje śmierć, wymaga hospitalizacji uczestnika, powoduje trwałą niepełnosprawność lub powoduje wadę wrodzoną. W takim przypadku raport zostanie zarejestrowany w ciągu 24 godzin od dowiedzenia się o zdarzeniu, a raport dla komisji etyki w ciągu 15 dni od dowiedzenia się o zdarzeniu. Formularz powinien być wypełniony maszynowo i podpisany przez głównego badacza. Główna KE potwierdzi otrzymanie raportów o bezpieczeństwie w ciągu 30 dni.

Zgodność i wycofanie się

Zgodność podmiotowa

Zgodność uczestnika będzie oceniana podczas każdej wizyty studyjnej. Samodzielnie sporządzona historia medyczna zapewni, że uczestnik nie podjął żadnych działań (np. nie zaczął brać udziału w innym badaniu klinicznym), nie zachorował na jakąś chorobę lub nie zaczął brać leków (np. przyjmowanie antybiotyków ogólnoustrojowych), co jest zabronione na podstawie kryteriów wykluczenia. Ponadto zgodność zostanie oceniona na podstawie badania krwi, biorąc pod uwagę zmniejszenie poziomu IGF-1 w krążeniu. Zostanie to odnotowane na liście kontrolnej w CRF. Każdy pacjent powinien prowadzić dziennik diety przez cały czas trwania badania, obejmujący cykle FMD dla pacjentów badanych. Niewypełnienie dziennika żywieniowego również zostanie odnotowane jako rezygnacja z badania ze względu na kluczowe znaczenie diety dla ważności badania. Wreszcie, jeśli uczestnik niespodziewanie nie pojawi się na wizycie studyjnej, zostanie poproszony o przybycie do kliniki przy najbliższej możliwej okazji.

Wycofanie się/rezygnacja z przedmiotów

Uczestnik może w każdej chwili wycofać się z badania. Odbywa się to poprzez ustną dyskusję pomiędzy uczestnikiem a dowolnym członkiem zespołu badawczego, a ich decyzja zostaje odnotowana w pisemnym formularzu wycofania. Przyczyną rezygnacji może być na przykład dyskomfort fizyczny lub zbyt duże zaangażowanie czasowe. Po zakończeniu analizy danych, podczas której zostaną zebrane wszystkie zanonimizowane dane, uczestnicy nie będą mogli już wycofać swoich danych z badania, co zostanie wyjaśnione na etapie wstępnej rekrutacji. Najpóźniejszym terminem jest koniec badania. Pewne okoliczności mogą wymagać od zespołu badawczego podjęcia decyzji o wycofaniu uczestników z badania, np. istotne nieprzestrzeganie protokołu, np. opuszczenie wielu wizyt badawczych lub inne zdarzenia spełniające kryteria wykluczenia. Wiązałoby się to z rozmową z uczestnikiem w celu poinformowania go i wyjaśnienia decyzji oraz odnotowania decyzji w pisemnym formularzu wycofania. Jeżeli podczas wizyty studyjnej zostanie ujawniona niezgodność, zostanie ona również odnotowana w sekcji „Dodatkowe uwagi” CRF. Uczestnicy nie zostaną zastąpieni w przypadku wycofania się poszczególnych osób.

Rozważania statystyczne

Obliczenie wielkości próbki

Nie opublikowano żadnych badań dotyczących stosowania FMD u pacjentów z zapaleniem przyzębia. Dlatego w literaturze nie są dostępne żadne dane na temat wykonalności i wymaganej wielkości próby. bardzo trudno jest oszacować, jaka byłaby prawidłowa wielkość próby badawczej, w związku z czym niniejsze badanie zaprojektowano jako pilotaż wewnętrzny. Podczas gdy Browne i współpracownicy (1995) sugerowali, że w celu ustalenia wielkości próby potrzebnych będzie 30 pacjentów, Kieser i Wassmer (1996) odkryli, że wielkość próby pilotażowej wynosząca od 20 do 40 zminimalizowałaby całkowitą wielkość próby w większym badaniu. Zgodnie z sugestią Juliousa z 2009 r. do tego badania zostanie włączonych 12 pacjentów w każdym ramieniu badania.

Analiza tymczasowa i kryteria wykonalności/postępu

Decyzja o kontynuacji większego badania (oraz względna wielkość próby) będzie zależała od poniższych kryteriów wykonalności/postępu.

ASPEKTY WYKONALNOŚCI KRYTERIA POSTĘPU DO SPEŁNIENIA

Skłonność do randomizacji ≥ 50% badanych pacjentów zgadza się Samoopisowe przestrzeganie diety ≥ 66% pacjentów z grupy testowej samoopisowe przestrzeganie diety (zdefiniowane jako nie więcej niż 1 dzień, w którym dieta nie była przestrzegana) Testowane przestrzeganie diety ≥ 66 % pacjentów w grupie testowej wykazuje zgodność na podstawie badania krwi (zdefiniowaną jako zmniejszenie poziomu IGF-1 w krążeniu o 20–30%) (Wei 2017) Akceptacja próbek krwi ≥ 66% zakwalifikowanych pacjentów ma pobrane wszystkie próbki krwi zgodnie z protokołem Nieobecność poważnych zdarzeń niepożądanych Żaden pacjent nie zgłosił poważnych zdarzeń niepożądanych, które mogłyby być związane z dietą testową

Jeżeli wszystkie powyższe kryteria zostaną spełnione, przeprowadzona zostanie analiza istniejących danych za okres do 3 miesięcy, z wykorzystaniem danych pochodzących od 24 pacjentów objętych „pilotem wewnętrznym”. Średnie i odchylenia standardowe wartości CRP po 3 miesiącach zostaną wykorzystane do obliczenia wymaganej wielkości próby dla większego badania. Obserwacja pacjentów biorących udział w badaniu będzie kontynuowana przez okres do 6 miesięcy po zakończeniu leczenia. Jeżeli różnica między grupami pod względem głównego wyniku badania (CRP po 3 miesiącach) będzie minimalna, co skutkuje bardzo dużą liczebnością próby, może zostać podjęta decyzja o nieprzystępowaniu do rekrutacji większej grupy pacjentów i rekrutacja zostanie wstrzymana. Jednakże pacjenci nadal biorący udział w badaniu będą obserwowani aż do ostatniej wizyty kontrolnej w badaniu (180 dni).

Analiza statystyczna

Głównym wynikiem badania jest stężenie CRP w krążeniu 3 miesiące po leczeniu (test vs. kontrola). Jednakże najpierw należy ukończyć wewnętrzną część badania dotyczącą pilotażu/wykonalności, zanim zostanie rozważone, czy kontynuować badanie na próbie o pełnej mocy. Jeśli spełnione zostaną kryteria wykonalności, do obliczenia wielkości próby zostanie wykorzystana różnica w poziomach CRP 3 miesiące po leczeniu pomiędzy grupami i zostanie sformułowany formalny plan statystyczny. Różne pakiety statystyczne będą używane do różnych celów, Stata 14 (StataCorp LLC, College Station, Teksas, USA) będzie pakietem głównym, a R (z wtyczką R-Studio) będzie używany do dodatkowych analiz, oba z określonymi procedurami stworzony na potrzeby tego badania. W celu sprawdzenia, czy analizowane zmienne ilościowe mają rozkład normalny, zostanie zastosowany test Shapiro-Wilka, a w przypadku tych, które go nie przestrzegają, zostanie przeprowadzona transformacja logarytmiczna. Opisany zostanie profil populacji i grup badawczych. Wyniki zmiennych jakościowych zostaną wyrażone w proporcjach, a zmienne ilościowe zostaną wyrażone jako średnie i odchylenie standardowe, z uwzględnieniem 95% przedziałów ufności. Uzyskany zostanie również rozkład populacji dla każdego z parametrów klinicznych, biochemicznych i mikrobiologicznych. Do analizy dwuwymiarowej wykorzystany zostanie test chi-kwadrat w celu ustalenia, czy istnieje statystycznie istotny związek pomiędzy dwiema zmiennymi jakościowymi, dane zostaną zaprezentowane w postaci tabel kontyngencji, gdy test Chi-kwadrat nie spełni warunków trafności dokładnego testu Fishera zostanie zastosowany.

Do porównania średnich dwóch zmiennych niezależnych dla analiz międzygrupowych zostanie wykorzystany test T-Studenta, uwzględniający test T-Studenta dla prób sparowanych w analizach wewnątrzgrupowych. Jeżeli normalne założenia nie zostaną spełnione, zastosowany zostanie test nieparametryczny „U Manna-Whitneya”. W przypadku analiz wewnątrzgrupowych stosowana będzie analiza ANOVA dla pomiarów powtarzalnych lub test Friedmana. Analiza wielowymiarowa zostanie przeprowadzona za pomocą modelu wielokrotnej regresji liniowej oraz porządkowej regresji logistycznej wprowadzającej do niej zmienne niezależne o niższym poziomie istotności 0,20. Warunki zostaną sprawdzone poprzez analizę resztową heteroskedastyczności i liniowości. Poziom istotności statystycznej dla tego badania wyniesie p<0,05.

Zasady zatrzymania/zaprzestania i łamania kodu randomizacyjnego

Badacze nie przewidują żadnego ryzyka związanego z pobieraniem próbek i pryszczycą, ponieważ są to procedury ugruntowane. Dlatego też badacze przewidują, że nie należy przerywać żadnej części badania ani przerywać badania ze względu na obawy dotyczące bezpieczeństwa uczestników. Jednakże, ponieważ FMD nie była badana u pacjentów z zapaleniem przyzębia, w mało prawdopodobnym przypadku wystąpienia poważnego zdarzenia niepożądanego raport dla Sponsora zostanie zarejestrowany w ciągu 24 godzin od dowiedzenia się o zdarzeniu, a raport dla komisji etyki w ciągu 15 dni dowiedzenia się o wydarzeniu. Następnie we współpracy z tymi organami zostanie podjęta decyzja, czy badanie należy zakończyć.