模拟禁食饮食与牙周炎 (FMD) (FMD)

介绍

牙周炎是一种微生物驱动的牙周炎性疾病。 研究表明，牙周炎相关炎症不仅限于牙周组织，还可能对身体其他部位产生深远的影响，这可能部分是由口腔微生物的全身传播介导的。 牙周治疗的第 1 步和第 2 步还与短期急性期炎症反应相关，其特征是循环急性期炎症标志物升高，如果成功的话，随后这些分子的长期减少。 从中长期来看，这会伴随着周围血管健康的其他标志物的变化以及代谢控制的改善，持续至少 12 个月。 已知牙周炎与代谢紊乱和失调具有双向关系。 最近的一项研究证实，牙周炎与通过血清 C 反应蛋白 (CRP) 水平测量的全身炎症有关。 此外，据报道，强化非手术牙周炎治疗（步骤 1 和 2）导致 CRP 在 90 天后逐渐降低，并在 180 天时适度增加。 人们认为代谢控制的改善也可能改善牙周结果，但其确切机制尚不完全清楚。 一些关于营养对牙周炎治疗可能产生的影响的人体和实验研究也已发表。 一项针对猴子的研究发现，长期饮食热量限制（富含维生素和矿物质的饮食）可以抑制临床炎症，并减少继发于急性微生物挑战的牙周破坏程度。 然而，在另一项针对猴子的实验研究中，长期低热量饮食（每天摄入的热量减少 30%，加上维生素和矿物质）似乎可以不同程度地降低雄性而非雌性局部炎症介质的产生和炎症性牙周病的风险。 此外，最近对动物模型的系统评价得出结论，对氧化应激或免疫系统有影响的常量营养素（即 n-3 脂肪酸）似乎对于预防或治疗牙周炎很重要。 在人体研究方面，韩国的一个研究小组对牙周健康的肥胖人群进行为期 4 周的体重控制干预后，观察到基质金属蛋白酶 (MMP)-8、MMP-9 和白细胞介素-1β (IL-1β) 的减少龈沟液（GCF）。 一个德国研究小组报告称，饮食中包含低碳水化合物摄入、富含 Omega 3 脂肪酸和纤维、较高维生素 C 和 D 值、减少动物蛋白以及集中摄入含硝酸盐的植物，可能会显着减少牙周和牙龈炎症，尽管血清学炎症参数和龈下微生物群似乎不受影响。 最近，一项研究发现，西方饮食模式（其特点是加工肉类、红肉、黄油、高脂肪乳制品、鸡蛋和精制谷物的摄入量较高）与谨慎的饮食模式（其特点是蔬菜、水果、豆类、全谷物、鱼和家禽的摄入量较高）和牙周炎；然而，当仅考虑肥胖者时，西方饮食与较高的牙周炎风险有关。 最近的另一项基于饮食炎症指数的调查表明，在美国普通成年人群中，食用促炎饮食与中重度牙周炎有关。 由于人们通常无法长期遵循严格的饮食习惯，因此引入了一种新的禁食模式，以提高患者的依从性。 特别是，模拟禁食饮食（FMD），连续 4-7 天摄入正常热量的 30-50%，然后每月一次随意重新进食，在降低风险方面显示出非常有希望的有益效果。衰老、糖尿病、自身免疫、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症的因素。 总体而言，定期禁食对牙周临床和炎症参数的潜在作用仍存在不确定性。 据我们所知，尚无研究调查 FMD 对牙周炎治疗后全身和牙周反应的潜在影响。

目标

本研究的主要目的是测试模拟禁食饮食是否可以影响非手术牙周治疗后的全身和牙周反应。 零假设是模拟禁食饮食不会改变局部和全身炎症治疗后反应。

学习规划

这是一项双盲（结果评估员和统计学家）、多中心、随机临床研究，具有平行组和 1:1 的分配比例，并有内部试点。 所有招募的患者将接受相同的牙周治疗方案（步骤 1 和 2）。 一组（测试）将接受三个周期的 FMD。 FMD 计划是一种以植物为基础的饮食计划，旨在获得类似禁食的效果，同时提供大量营养素和微量营养素，以最大程度地减少禁食和不良影响的负担。 FMD 由 100% 通常被认为是安全的 (GRAS) 成分组成，包括专有的蔬菜汤、能量棒、能量饮料、饼干零食、橄榄、花草茶和补充剂。 每天消耗的所有物品均单独装箱，以便受试者选择何时进食，同时避免意外消耗第二天的成分。 FMD 包括为期 5 天的治疗方案，第一天提供约 1,100 卡路里热量；第二天到第五天每天大约750大卡。 相反，另一组（对照组）将继续正常饮食。

科目选择

这是一项多中心研究。 参与者将由加泰罗尼亚国际大学（UIC）、马德里康普顿斯大学（UCM）、圣地亚哥德孔波斯特拉大学、穆尔西亚大学和格拉纳达大学的临床工作人员/学生在各自医院就诊的牙周炎患者中进行筛选。 研究人员预计每年有 24 名符合资格的参与者，并假设其中 70% 在表达最初兴趣后会同意参加试验。

学习程序

受试者招募

加泰罗尼亚国际大学、康普顿斯大学、圣地亚哥德孔波斯特拉大学和格拉纳达大学的患者将在校园和牙科学院内单独招募患者。 在表达初步兴趣后，潜在参与者将获得一份信息表，并有机会通过电子邮件或电话向研究团队成员提问。 如果他们表达了参与的愿望，他们将被邀请参加筛选访问。 每个人将有至少 24 小时到最多一周的时间来决定是否愿意参加。 个人将在研究完成后获得报酬。

筛选程序

在筛选访视时，将征求经过培训的申请人或研究牙医的同意，并通过书面参与者同意书记录，详细说明完整的试验程序和每种数据收集方法的协议清单。 一旦获得同意，每位登记的参与者将被记录在参与者日志表中。 初步筛选将确保每个人都符合概述的纳入和排除标准。 这将通过口述病史进行评估，并将记录在硬拷贝筛查日志表上。 参与者需要接受研究牙医的牙周检查以确保适合。

随机化程序和分配隐藏

最初的中心随机化将由盖伊医院未直接参与研究的人员使用“密封信封”方法进行。 对于重要的影响因素（“中心”），将按照建议进行分层随机化。 不会按年龄进行分层，因为对于小样本量，分层应仅限于一个或很少的因素，并且年龄的影响受到研究设计的限制，并将在统计分析中进行调整。 对于每个中心，患者将使用研究统计学家之前准备的随机列表分配到两个治疗组之一。 该列表将通过分块随机化生成。 各中心均采用密封信封，确保分配隐蔽性。 参与者将被分配在第 -7/-10 天和第 0 天之间接受测试或对照治疗。治疗师将在治疗预约开始时打开信封，了解治疗分配情况。

每次访问的时间表

通过面对面讨论或对广告的回应表示有一定兴趣参与的参与者将被邀请参加筛选访问。 与所有研究访问一样，该研究将在加泰罗尼亚综合医院（巴塞罗那）以及马德里、圣地亚哥德孔波斯特拉、穆尔西亚和格拉纳达的牙口腔病科 (Clinica de Odontologia) 进行，大约需要 45 分钟。 这将在临床空间可用性的范围内，在潜在参与者和研究牙医双方都方便的时间和日期进行。 在这里，他们将首先被询问其个人信息/病史并接受牙科检查。 如果他们符合资格，我们将通知他们下一阶段的研究何时开始，并在预约后开始调查。 治疗将由每个中心的牙周病学硕士研究生提供。

一到两周后的第 -7/-10 天（基线预约或访问 1），将给予并签署知情同意书。 将收集血液、GCF、斑块和粪便样本。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查，包括记录牙齿数量和每颗牙齿 6 个部位的探诊深度、后退（毫米）和探诊后出血。 将提供非常肤浅的预防、动机和口腔卫生指导。

第 0 天（早上）（访视 2），分配到测试组的患者将开始连续 5 天的 FMD。 所有患者都将接受全口龈下器械（PMPR）手术，并将加强更详细的卫生指导。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。 训练有素的注册营养师（来自其中一个中心）将与患者讨论口蹄疫，并分发调查报告以报告未吃的食物和消耗的额外食物。

第 1 天 (v3)，将采集血液和 GCF 样本。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。

第 7 天 (v4)，将采集血液和 GCF 样本。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。

在第 45±5 (v5) 天，将采集血液和 GCF 样本。 将加强口腔卫生指导，并提供龈上洁牙和抛光疗程。 第二个周期的 FMD 将在测试组患者中开始。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。

在第 85 ±5 (v6) 天，测试组患者将开始第三个周期的 FMD。 将检查病史、不良事件和伴随药物，加强口腔卫生指导，并提供龈上洁治和抛光。

在第 90 ±5 (v7) 天，将记录全口牙周图测量结果。 将采集血液样本和 GCF 样本。 将加强口腔卫生指导，如有必要，将提供牙周支持治疗。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。

在第 180 ±10 (v8) 天，将记录每颗牙齿 6 个部位的全口牙周图测量结果：探诊深度、退缩 (mm) 和探诊后出血。 将采集血液、GCF、斑块和粪便样本。 将加强口腔卫生指导。 将检查病史、不良事件和伴随药物，并进行口腔检查以筛查并发症。

*在每个 FMD 周期内，将给患者打电话一到两次，以检查一切是否正常进行，并解决他们可能遇到的任何问题或疑虑。

跟进程序

如果参与者错过多次 (2/3) 访问，他们可能会被视为退出。 然而，它们将被纳入意向治疗分析中。

研究结束定义

一旦所有参与者完成临床阶段的所有阶段，并且对生物材料和临床评分进行处理/分析，研究将完成。

样品采集/标签/记录

样本将由参与本研究的加泰罗尼亚国际大学、马德里康普顿斯大学、圣地亚哥德孔波斯特拉大学、穆尔西亚大学和格拉纳达大学的合格牙医在研究访问期间从患者身上采集。 在收集所有样本类型期间，将使用适当的手部卫生、合适的手套和无菌的一次性检查物品，以确保所收集样本的完整性以及检查者和参与者的安全。 每次访问之前将准备好伪匿名标记的试管，标签由参与者编号组成，前缀为样本类型名称，例如： G代表GCF，B代表血液，S代表唾液，SubP代表龈下菌斑等。每次就诊时都会在临床检查前采集样本，以防止物理操作干扰采样部位或造成轻微牙龈损伤出血可能会污染所采集的样品。 GCF Periopaper® 牙贴（Pro-flow Inc.，Amityville，纽约，美国）将被放置在每个象限中最深的牙袋部位（颊侧）的牙齿牙龈缝隙中。 然后立即在经过校准的 Periotron 8000（Pro-Flow Inc.，Amityville，纽约，美国）电子传感器上进行测量，这将量化收集的 GCF 量。 测量完成后，该次就诊的 GCF 试纸条将全部储存在 -80°C 的单个 2ml 试管中，并汇集起来以供进一步分析。 将从参与者的手臂收集 4ml 静脉血，放入 Hemogard 安全封闭盖的真空采血管中，其中含有已喷涂在试管内表面上的 EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝剂 K2 钾盐。 样本将由经验丰富且训练有素的抽血师采集。 为了降低晕厥的风险，在整个采样过程中以及采样后五分钟内，参与者将处于半倾斜的底座上。 研究人员将始终陪伴在参与者身边，以确保在晕倒时不会跌倒或受伤。 用过的针头将被丢弃到安全的锐器箱中。 血清样品将以 11,000 RPM 离心 10 分钟，然后立即分成 0.2ml - 0.5ml 等份，并储存在 -80°C 的冰箱中，直到需要进行分析。 研究牙医将使用无菌刮匙分别从牙龈边缘下方从牙齿的颊面采集龈下菌斑样本。 每次研究访视时，将从具有最深袋位（颊面）的牙齿收集牙菌斑。 这些牙齿被选择为具有良好的臼齿和门牙组合。 从这四颗牙齿收集的牙菌斑将汇集到 1ml 无菌 0.1x Tris-EDTA 中并储存在 -80°C 下。 将为参与者提供家庭收集套件，用于对保存溶液中的粪便进行取样 ([http://www.microbiome-standards.org)] http://www.microbiome- 标准.org） 该样本将在采集后 7 天内邮寄至当地实验室。 实验室收到粪便样本后，样本将储存在-80°C。所有生物污染的一次性物品将被丢弃到正确的生物危害箱中进行处理和清除。 采集的所有样本都将记录在参与者该次研究访视的硬拷贝 CRF 上，并记录收集的日期和时间以及收集研究牙医的姓名缩写。 这也将被记录到研究 Excel 电子表格中。 如果在那次访问时无法采集特定样本，则原因将在 CRF 的相应“附加说明”部分中说明。

样品分析程序

所有实验将在盖伊医院的微生物组和唾液实验室进行。 GCF 样品将在补充有 Easypack 蛋白酶抑制剂混合物 (Roche) 的 PBS (pH 7.2±0.2) 中解冻并洗脱，如 Curtis 等人所述。 1988年。 简而言之，将周纸条放入穿孔的 0.5ml 微量离心管中，该离心管将固定在 1.5ml 管内。 将洗脱缓冲液 (50μL) 添加到试纸条上，并置于涡旋振荡器中 2 分钟，然后在 4°C 下以 11,000 rpm 离心 15 分钟。 将另外 50μL 的洗脱缓冲液添加到试纸条上，重复离心，以产生约 90μL 的总洗脱 GCF。 蛋白质浓度将使用用牛血清白蛋白 (Sigma) 校准的 LVis 板 (BMG Labtech CLARIOstar) 进行定量。 Luminex 将对选定分析物进行 GCF 分析。 样本将在 KCL 宿主微生物组相互作用中心（位于 Guys Tower Wing 17 号）进行处理。 牙菌斑和粪便样本将按照我们实验室的标准程序进行 DNA 提取，并使用下一代 DNA 测序进行分析，以表征龈下微生物群，从而识别和确定关键牙周细菌病原体的水平以及治疗部位的微生物群落变化具有测试和控制协议。 将使用蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定 (ELISA) 等各种技术来测试血液样本中的细胞因子、急性期蛋白和炎症标记物，从而确定血液中这些物质的存在和含量。 将再次使用 ELISA 等技术分析龈沟液中的炎症介质、抗体、肽和细胞因子。 将评估IGF-1的循环水平、空腹血糖水平、血液β-羟基丁酸水平，以监测FMD的依从性。

ELISA（高灵敏度双位点酶联免疫吸附测定）：IL-6检测。

Cobas Integra 700（自动免疫比浊高灵敏度测定）：HsCRP 检测。

这些实验产生的数据将存储在受密码保护的安全的国王计算机上，包括唾液和微生物组实验室以及国王提供的研究笔记本电脑。

样品储存程序

血液、唾液、牙菌斑和GCF样本将被储存在加泰罗尼亚国际大学、马德里康普顿斯大学、圣地亚哥德孔波斯特拉大学和格拉纳达大学实验室的安全、上锁的HTA冰箱中，温度为-80°C。 这将确保样品处理准备工作的长期稳定性。 收集后，粪便样本将由患者装在预先贴好邮票的密封信封中发送到每个参与中心。 存储时，所有样品都将接受物理完整性检查，待冷冻的样品将被登录到受密码保护的安全计算机数据库中，该数据库记录了它们在冰箱中的位置以及存储的时间/日期。 记录所存储样本的物理硬拷贝也将出现在 CRF 上。 所提供样本的储存、运输、使用和最终处置将按照《2004​​ 年英国人体组织法》以及《欧盟组织和细胞指令》进行。 如果任何样本没有立即处理，它们将被伪匿名存储以供日后进一步分析。 样本将被转移到盖伊医院唾液实验室，并在完成后存档10年。 研究伦理批准到期后，血液、唾液和 GCF 样本将根据《2004​​ 年人体组织法》及其任何修正案进行处理，或转移至组织库。

将样品从西班牙运送到英国

样品将被放置在冰屋中，冰屋中可以容纳足够的冰/干冰，以确保样品在比预计的运输时间更长的时间内保持在正确的温度下。 然后，聚苯乙烯冰屋部分填充冰/干冰，为样品和额外的冰留出空间。 样品可以放置在密封的塑料袋中以帮助编目。 然后冰屋中充满干冰以覆盖样品和发货表，此外，还包括密封塑料样本袋中的地址标签副本。 冰屋上将盖上盖子，并用包装带固定。 随后，冰屋会被用坚固的棕色包装纸包裹，并在交货前贴上地址标签和极低温危险标签。 它将选择最快的运输工具（例如飞机），以便尽快完成运输。

安全评估

研究人员预计参与样本采集（包括血液样本）的参与者不会面临任何重大风险，因为这些都是完善的程序。 根据之前的文献，可能的风险可能涉及 FMD 饮食方案引起的一些轻度/中度全身不良事件，包括疲劳、虚弱和头痛。 在采血期间或之后也存在轻微晕厥的风险。 为了降低这种风险，在整个采样过程中以及采样后五分钟内，参与者将坐在半躺的底座上。 研究人员将始终陪伴在参与者身边，以确保在晕倒时不会跌倒或受伤。 如果检查人员在采集血样时发生针刺伤或划伤，将实施当地程序来应对此类事件。 研究过程中预计不会发生严重不良事件。

道德报告

不良事件是指与研究相关的任何不利和非预期的体征、症状或疾病。 如果发生不良事件，例如在采血过程中昏厥，研究者将通知首席研究者，并将其包含在研究文件 CRF 中。 严重不良事件 (SAE) 是指导致参与者死亡、需要住院治疗、导致持续残疾或导致出生缺陷的事件。 如果发生这种情况，我们将在获悉该事件后 24 小时内记录一份报告，并在获悉该事件后 15 天内向道德委员会报告。 该表格应以打字稿填写并由首席研究员签署。 主要 REC 将在 30 天内确认收到安全报告。

合规与撤回

主体合规性

每次研究访问时都会评估参与者的依从性。 自我报告的病史将确保参与者没有采取任何行动（例如，开始参加另一项临床试验）或出现病症或开始服用药物（例如，服用药物）。 服用全身性抗生素），这是排除标准所禁止的。 此外，将根据血液测试评估依从性，并考虑 IGF-1 循环水平的降低。 这将记录在 CRF 的清单上。 每个患者都应在整个研究过程中填写饮食日记，包括测试患者的 FMD 周期。 由于饮食对于研究的有效性至关重要，未能完成饮食日记也将被记录为退出。 最后，如果参与者意外未能参加研究访问，他们将被要求在下一个可能的机会去诊所。

撤回/退出科目

参与者可以随时退出研究。 这将通过参与者和任何研究团队之间的口头讨论进行，他们的决定会记录在书面退出表格上。 退出的原因可能是由于身体不适或投入过多的时间。 数据分析完成后，所有匿名数据都将被整理，参与者将无法再从研究中撤回他们的数据，这一点将在最初的招募阶段明确。 最晚的日期是在研究结束时。 某些情况可能需要研究团队决定从试验中撤回参与者，例如严重不遵守方案，例如错过多次研究访视，或满足排除标准的其他事件。 这将涉及与参与者交谈，向他们告知和解释该决定，并将该决定记录在书面退出表格上。 如果在研究访问中发现不合规情况，也会记录在 CRF 的“附加注释”部分中。 当个人退出时，受试者不会被替换。

统计方面的考虑

样本量计算

尚未发表在牙周炎患者中使用 FMD 的研究。 因此，文献中没有关于可行性和所需样本量的数据。 很难估计正确的研究样本量是多少，因此，这项研究被设计为内部试点。 Browne 和同事 (1995) 建议根据经验法则确定样本量需要 30 名患者，而 Kieser & Wassmer (1996) 发现试点样本量在 20 到 40 之间可以最大限度地减少大型研究的总体样本量。 根据 Julious 2009 年的建议，每个研究组将招募 12 名患者参与本研究。

中期分析和可行性/进展标准

进行更大试验（以及相对样本量）的决定将取决于下面的可行性/进展标准。

可行性方面需要满足的进展标准

随机化意愿 ≥ 50% 的受访患者同意 自我报告的饮食依从性 ≥ 66% 的测试组患者自我报告的依从性（定义为不遵循饮食的时间不超过 1 天） 测试的饮食依从性 ≥ 66测试组患者中根据血液检测表现出依从性的百分比（定义为 IGF-1 循环水平降低 20% 至 30%）（Wei 2017） 接受血液样本 ≥ 66% 的招募患者按照方案采集了所有血液样本 不存在严重不良事件 没有患者报告可能与测试饮食有关的严重不良事件

如果满足上述所有标准，将使用 24 名“内部试点”患者的数据对长达 3 个月的现有数据进行分析。 3 个月时 CRP 值的平均值和标准差将用于计算较大试验所需的样本量。 研究患者的随访将在治疗后持续长达 6 个月。 如果主要结局（3 个月时的 CRP）各组之间的差异很小，导致样本量非常大，则可以决定不继续招募更大的患者组，并且招募将停止。 然而，仍在研究中的患者将接受随访，直至最后一次研究随访（180 天）。

统计分析

该研究的主要结果是治疗后 3 个月的循环 CRP 水平（测试与对照）。 然而，在考虑是否继续进行全动力研究样本量之前，需要先完成研究的内部试点/可行性部分。 如果符合可行性标准，则以治疗后3个月各组间CRP水平的差异作为样本量，并制定正式的统计计划。 不同的统计软件包将用于不同的目的，Stata 14（StataCorp LLC，美国德克萨斯州大学城）将是主软件包，R（带有 R-Studio 插件）将用于附加分析，两者都有特定的例程为此研究而创建。 将应用夏皮罗-威尔克检验来验证分析的定量变量是否遵循正态分布，并对不遵循正态分布的变量进行对数变换。 将描述人口和研究组的概况。 定性变量的结果将以比例表示，定量变量以平均值和标准差表示，包括 95% 置信区间。 还将获得每个临床、生化和微生物学参数的群体分布。 对于双变量分析，将使用卡方检验来确定两个定性变量之间是否存在统计上显着的关联，当卡方检验不满足有效性条件时，数据将以列联表的形式呈现 Fisher 精确检验将被应用。

为了比较组间分析的两个自变量的平均值，将使用学生 T 检验，并考虑组内分析中配对样本的学生 T 检验。 如果不满足正常假设，则将应用无参数“Mann-Whitney U”检验。 对于组内分析，将使用重复测量的方差分析或弗里德曼检验。 多变量分析将通过多元线性回归模型和有序逻辑回归进行，其中引入具有较低显着性水平0.20的自变量。 将通过异方差和线性的残差分析来检查条件。 本研究的统计显着性水平将为 p<0.05。

停止/终止规则和破坏随机化代码

研究人员预计样本采集和 FMD 不会涉及任何风险，因为这些都是完善的程序。 因此，研究人员预计研究的任何部分都不需要停止，试验也不需要因为参与者的安全问题而停止。 然而，由于 FMD 尚未在牙周炎患者中进行测试，万一发生严重不良事件，将在得知该事件后 24 小时内向申办方记录报告，并在 15 天内向伦理委员会报告的事件学习。 然后将与这些机构一起决定是否应停止该研究。