Biomarkery w zapaleniu tkanek okołowierzchołkowych

Wielkość próby została obliczona przy użyciu programu G*Power v3.1 (Uniwersytet Heinricha Heinego, Düsseldorf). Na podstawie poziomu istotności 0,05 i mocy testu 0,90 ustalono, że wystarczy 18 prób na grupę. Uwzględniając potencjalne wypadnięcia, planuje się włączenie łącznie 66 pacjentów.

Kryteria włączenia:

Pacjenci płci męskiej w wieku 18-35 lat. Przewlekłe zapalenie przyzębia wierzchołkowego w siekaczach, kłach lub jedno-korzeniowych/jedno-kanałowych przedtrzonowcach szczęki lub żuchwy. Historia leczenia kanałowego przeprowadzonego co najmniej 4 lata temu. Obecność zmiany okołowierzchołkowej (<1 cm) z wynikiem Orstavik PAI 3 lub 4. Zgodność etyczna będzie zapewniona poprzez świadomą zgodę; pacjenci zostaną poinformowani o badaniu, a chętni do udziału podpiszą dobrowolną formę świadomej zgody. Dane demograficzne pacjentów (imię, wiek, płeć), informacje kontaktowe, numer zęba oraz objawy kliniczne/ustalenia będą rejestrowane w formularzach raportów przypadku (CRF).

Kryteria wykluczenia:

Pacjenci wymagający antybiotykowej profilaktyki, chorzy na cukrzycę lub choroby hematologiczne, lub ci, którzy stosowali antybiotyki/leki przeciwzapalne w ciągu ostatniego miesiąca. Pacjentki w ciąży, zęby z obfitą płytką nazębną/kamieniem, zaczerwienieniem/krwawieniem dziąseł, ciężkim zapaleniem dziąseł, uogólnionym zapaleniem przyzębia lub głębokością kieszonek dziąsłowych >3 mm. Zęby z przetokami, resorpcją wewnętrzną/ zewnętrzną, obrzękiem lub bolesnością przy palpacji również zostaną wykluczone. Protokół leczenia Zastosowane zostanie znieczulenie miejscowe [1,8 ml 4% artykainy HCl z 1:100 000 epinefryny (Ultracain DS Forte)]. Zęby zostaną odizolowane za pomocą koferdamu (OpalDam, Ultradent). Aseptykę utrzyma się przy użyciu 30% H₂O₂ i 2,5% NaOCl (Werax). Po przygotowaniu dostępu, trzecia część koronowa gutaperki zostanie usunięta za pomocą wierteł Gates Glidden nr 3 i 4. Wszystkie procedury będą wykonywane pod dużym powiększeniem przy użyciu mikroskopu stomatologicznego (Carl Zeiss Meditec AG). Długość robocza (WL) zostanie określona za pomocą elektronicznego lokalizatora wierzchołka (Morita Root ZX Mini). Instrumentację kanału zakończy się przy użyciu pilników Reciproc R25 i R50 (VDW) na długości roboczej. Jeśli resztki gutaperki są widoczne radiologicznie, przeprowadzi się dodatkowe opracowanie dużymi ręcznymi pilnikami K. Kanały będą płukane 2 ml 2,5% NaOCl po każdej zmianie pilnika przy użyciu igły boczno-wentylowanej 30G (NaviTip). Rekapitulacja zostanie wykonana w celu utrzymania drożności wierzchołkowej. Aby dezaktywować NaOCl, użyje się 0,5% tiosiarczanu sodu, a następnie 5 ml soli fizjologicznej. Warstwę smear usunie się 5 ml 17% EDTA i końcowym płukaniem 5 ml soli fizjologicznej. Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do trzech grup końcowego płukania (n=22 na grupę) przy użyciu internetowego randomizatora (www.randomizer.org). Konwencjonalne płukanie strzykawkowe (CSI): 10 ml 2,5% NaOCl aplikowane przez 1 minutę przy użyciu igły 30G umieszczonej 1 mm przed długością roboczą. Aktywacja płukania ultradźwiękowego (UI): 10 ml 2,5% NaOCl aplikowane przy użyciu urządzenia ultradźwiękowego (EMS miniPiezon) i końcówki pilnika K (#25) z mocą 50% z ruchami góra-dół przez 1 minutę. SWEEPS (Shock Wave Enhanced Emission Photoacoustic Streaming): laser Er:YAG (LightWalker AT, Fotona) o długości fali 2940 nm, czasie trwania impulsu 50 µs, końcówce H14, trybie SWEEPS (0,3 W, 15 Hz, 20 mJ). Końcówka światłowodowa 600 µm (PIPS 600/9) będzie trzymana nieruchomo w dostępie, podczas gdy 10 ml 2,5% NaOCl będzie aktywowane w czterech 15-sekundowych cyklach. Po pierwszej sesji zostanie zastosowane leczenie wodorotlenkiem wapnia, a dostęp zostanie zamknięty sterylną taśmą teflonową i cementem fosforanowym cynku. Tydzień później, podczas drugiej sesji, powtórzy się izolację i aseptykę, a następnie pobierze drugie próbki wysięku okołowierzchołkowego (PAE) przed dokończeniem leczenia kanałowego i stałej odbudowy kompozytowej.

Procedura pobierania próbek okołowierzchołkowych: Po końcowym płukaniu, kanały zostaną osuszone sterylnymi szpulkami papierowymi. Pobieranie próbek zostanie wykonane przy użyciu sterylnych szpulek papierowych #20 umieszczonych 2 mm poza otworem wierzchołkowym na 60 sekund. Wierzchołkowe 4 mm szpulki zostaną odcięte sterylnymi nożyczkami i umieszczone w sterylnej probówce Eppendorf. Proces ten zostanie powtórzony trzykrotnie. Analiza ELISA Próbki przechowywane w -80°C zostaną rozmrożone i do każdej probówki dodane zostanie 300 µL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS, pH 7,2). Próbki zostaną zmieszane w wirówce vortex z częstotliwością 25 Hz przez 1 minutę. Homogenizację tkanek przeprowadzi się przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego (Sonics Vibra-cell) przez 1 minutę, a następnie wirowania przy 5000 obr./min przez 5 minut w temperaturze +4°C. Poziomy TNF-α, IL-1β i MMP-9 zostaną zmierzone przy użyciu zestawów ELISA przy absorbancji 450 nm.

Analiza statystyczna Dane zostaną przeanalizowane przy użyciu IBM SPSS Statistics v20. Analiza regresji liniowej zidentyfikuje czynniki (grupa leczenia, płeć, numer zęba, wiek) wpływające na procentową zmianę biomarkerów. Jeśli dane nie będą miały rozkładu normalnego, test Wilcoxona zostanie użyty do porównań przed i po leczeniu, a test Kruskala-Wallisa do porównań międzygrupowych. Rozkład wieku zostanie przeanalizowany za pomocą testu Kruskala-Wallisa, a rozkład płci/ numeru zęba za pomocą testu Chi-kwadrat. Istotność ustalono na (p < 0,05).