Biomarkery v apikální periodontitidě

Velikost vzorku byla vypočtena pomocí programu G*Power v3.1 (Heinrich Heine University, Düsseldorf). Na základě hladiny významnosti 0,05 a síly testu 0,90 bylo určeno, že 18 vzorků na skupinu je dostatečných. S ohledem na možné výpadky je plánováno zařazení celkem 66 pacientů.

Kritéria zařazení:

Mužští pacienti ve věku 18–35 let. Chronická apikální periodontitida v horních nebo dolních řezácích, špičácích nebo jednokořenových/jednokanálových premolárech. Historie ošetření kořenových kanálků provedeného před alespoň 4 lety. Přítomnost periapikální léze (<1 cm) s Orstavikovým PAI skóre 3 nebo 4. Etická shoda bude zajištěna prostřednictvím informovaného souhlasu; pacienti budou seznámeni se studií a ti, kteří budou chtít účast, podepíší dobrovolný formulář informovaného souhlasu. Demografické údaje pacientů (jméno, věk, pohlaví), kontaktní informace, číslo zubu a klinické příznaky/nálezy budou zaznamenány v formulářích případových zpráv (CRF).

Kritéria vyloučení:

Pacienti vyžadující antibiotickou profylaxi, pacienti s diabetem nebo hematologickými onemocněními nebo ti, kteří v posledním měsíci užívali antibiotika/protizánětlivé léky. Těhotné pacientky, zuby s výrazným plakem/kameny, zarudnutím/krvácením dásní, těžkou gingivitidou, generalizovanou periodontitidou nebo hloubkou parodontálních chobotů >3 mm. Zuby s fistulami, interní/externí resorpcí, otokem nebo bolestí při palpaci budou také vyloučeny. Protokol léčby Bude aplikována lokální anestezie [1,8 ml 4% artikain HCl s 1:100 000 epinefrinu (Ultracain DS Forte)]. Zuby budou izolovány pomocí kofferdamu (OpalDam, Ultradent). Asepsie bude udržována pomocí 30% H₂O₂ a 2,5% NaOCl (Werax). Po přípravě přístupové dutiny bude koronální třetina guttaperči odstraněna pomocí vrtáků Gates Glidden č. 3 a č. 4. Všechny procedury budou provedeny pod vysokým zvětšením pomocí dentálního operačního mikroskopu (Carl Zeiss Meditec AG). Pracovní délka (WL) bude určena elektronickým apex lokátorem (Morita Root ZX Mini). Instrumentace kanálků bude dokončena pomocí souborů Reciproc R25 a R50 (VDW) na WL. Pokud budou zbytky guttaperči radiograficky viditelné, bude provedena další příprava s velkými ručními K-soubory. Kanálky budou po každé výměně souboru irrigovány 2 ml 2,5% NaOCl pomocí 30G jehly s bočním vývodem (NaviTip). Bude provedena rekapitulace pro udržení apikální průchodnosti. Pro inaktivaci NaOCl bude použit 0,5% thiosíran sodný, následovaný 5 ml fyziologického roztoku. Smear vrstva bude odstraněna 5 ml 17% EDTA a závěrečným 5 ml výplachem fyziologickým roztokem. Pacienti budou náhodně rozděleni do tří skupin pro závěrečnou irrigaci (n=22 na skupinu) pomocí online randomizátoru (www.randomizer.org). Konvenční stříkačková irrigace (CSI): 10 ml 2,5% NaOCl aplikováno po dobu 1 minuty pomocí 30G jehly umístěné 1 mm před WL. Ultrazvuková aktivace irrigace (UI): 10 ml 2,5% NaOCl aplikováno pomocí ultrazvukového zařízení (EMS miniPiezon) a hrotu K-souboru (#25) na 50% výkonu s pohyby nahoru a dolů po dobu 1 minuty. SWEEPS (Shock Wave Enhanced Emission Photoacoustic Streaming): Er:YAG laser (LightWalker AT, Fotona) na 2940 nm, doba pulzu 50 µs, koncovka H14, režim SWEEPS (0,3 W, 15 Hz, 20 mJ). Vláknový hrot 600 µm (PIPS 600/9) bude držen stacionárně v přístupové dutině, zatímco 10 ml 2,5% NaOCl bude aktivováno ve čtyřech 15sekundových cyklech. Po první seanci bude aplikována medikace hydroxidem vápenatým a přístupová dutina bude uzavřena sterilní Teflon páskou a fosfátovým cementem. O týden později, při druhé seanci, bude izolace a asepse opakována a budou odebrány druhé vzorky periapikálního exsudátu (PAE) před dokončením ošetření kořenových kanálků a trvalé kompozitní výplně.

Procedura periapikálního odběru: Po závěrečné irrigaci budou kanálky vysušeny sterilními papírovými body. Odběr bude proveden pomocí sterilních papírových bodů č. 20 umístěných 2 mm za apikální foramen po dobu 60 sekund. Apikálních 4 mm papírového bodu bude odstřiženo sterilními nůžkami a umístěno do sterilní Eppendorfovy zkumavky. Tento proces bude opakován třikrát. ELISA analýza Vzorky skladované při -80°C budou rozmraženy a do každé zkumavky bude přidáno 300 µL Dulbeccova fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku (DPBS, pH 7,2). Vzorky budou vortexovány při 25 Hz po dobu 1 minuty. Homogenizace tkáně bude provedena pomocí ultrazvukového homogenizátoru (Sonics Vibra-cell) po dobu 1 minuty, následovaná centrifugací při 5000 ot./min. po dobu 5 minut při +4°C. Hladiny TNF-α, IL-1β a MMP-9 budou měřeny pomocí ELISA souprav při absorpci 450 nm.

Statistická analýza Data budou analyzována pomocí IBM SPSS Statistics v20. Lineární regresní analýza identifikuje faktory (léčebná skupina, pohlaví, číslo zubu, věk) ovlivňující procentuální změnu biomarkerů. Pokud data nebudou normálně rozdělena, bude pro před- vs. po-ošetřovací srovnání použit Wilcoxonův test a pro meziskupinová srovnání Kruskalův-Wallisův test. Rozdělení věku bude analyzováno pomocí Kruskalova-Wallisova testu a rozdělení pohlaví/čísla zubu pomocí chí-kvadrát testu. Hladina významnosti je stanovena na (p < 0,05).