Strategie żywieniowe w leczeniu fibromialgii u pacjentów z nadwagą i otyłością (FIBRODIET)

Fibromialgia (FM) jest heterogennym i upośledzającym zespółem charakteryzującym się bólem wielomiejscowym, zaburzeniami snu, dysfunkcją poznawczą („mgła fibromialgiczna”) i zmęczeniem. Częstość występowania FM wynosi około 1–5% w populacji dorosłych, przy globalnym stosunku kobiet do mężczyzn około 3:1.

Etiopatogeneza choroby pozostaje niejasna; jednakże rosnąca liczba dowodów sugeruje, że FM jest zaburzeniem ośrodkowym, które generuje ból poprzez zmienione przetwarzanie bodźców niebolesnych lub słabo bolesnych. Ból w FM klasyfikuje się jako nociplastyczny, zdefiniowany jako „ból wynikający ze zmienionej nocycepcji, pomimo braku wyraźnych dowodów na rzeczywiste lub zagrażające uszkodzenie tkanek powodujące aktywację obwodowych nocyceptorów”. Ostatnio zaproponowano teoretyczny model patogenezy FM, oparty na obszernej literaturze sugerującej rolę kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) – głównego neuroprzekaźnika hamującego ośrodkowego układu nerwowego – w patofizjologii przewlekłych stanów bólowych, takich jak FM. W szczególności proponowany model zakłada, że zmniejszona neurotransmisja GABA-ergiczna na poziomie wzgórzowo-korowym – potencjalnie związana z zaburzeniem równowagi neuroendokrynnej prowadzącym do zmienionej aktywności neurosteroidów z dodatnią allosteryczną modulacją receptorów GABA-A lub receptorów NMDA – może przyczyniać się do rozwoju bólu w fibromialgii. Ta hipoteza wymaga walidacji poprzez badania przedkliniczne i interwencyjne.

FM jest zazwyczaj leczona za pomocą podejścia multimodalnego, które obejmuje zarówno strategie nielecznicze, jak i farmakologiczne. Najczęstsze interwencje nielecznicze obejmują fizjoterapię, techniki relaksacyjne, psychoterapię, akupunkturę i terapię dietetyczną.

Dieta jest w rzeczywistości głównym czynnikiem zdolnym wpływać na oś mikrobiom–jelito–mózg, a dysbioza została powiązana z wieloma zaburzeniami o ośrodkowym podłożu, w tym ze zmienioną nocycepcją i FM. Rzeczywiście, metabolity mikrobiologiczne – w szczególności krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) – są w stanie modulować neurotransmisję ośrodkową poprzez zmianę, na przykład, stosunku GABA/glutaminianu. Ponadto częstość występowania nadwagi/otyłości sięga 70% u pacjentów z FM, wartość istotnie wyższa niż w populacji ogólnej. Wysoka częstość występowania nadwagi/otyłości, dysbiozy i zmian żołądkowo-jelitowych w FM sugeruje, że terapia dietetyczna i oś mikrobiom–jelito–mózg mogą odgrywać ważną rolę w patogenezie FM.

Chociaż dane dotyczące związku między różnymi podejściami dietetycznymi a FM są ograniczone, dieta śródziemnomorska została powiązana z niższym natężeniem bólu, według badania obserwacyjnego przeprowadzonego na 186 osobach z FM. Badanie pilotażowe z udziałem 18 pacjentów również wykazało skuteczność diety ketogennej nie tylko w promowaniu utraty masy ciała, ale także w poprawie nasilenia objawów u otyłych kobiet z FM. Podobnie dowody sugerują, że dieta ketogenna może zwiększać poziom GABA i, szerzej, zwiększać stosunek GABA/glutaminianu.

W tym kontekście, oprócz terapii dietetycznej, może być zasadne rozważenie suplementacji szczepami bakteryjnymi zdolnymi do wytwarzania neuroprzekaźników – takich jak GABA – które mogą być niedoborowe u pacjentów z FM i mogłyby wywierać korzystny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy.

Głównym celem tego badania jest ocena wpływu określonego podejścia dietetycznego – diety ketogennej, diety śródziemnomorskiej lub diety śródziemnomorskiej suplementowanej probiotykami wytwarzającymi GABA, takimi jak Bifidobacterium adolescentis PRL2019 – na nasilenie FM, ze szczególnym uwzględnieniem bólu, jakości snu, lęku i depresji, ocenianych za pomocą zwalidowanych kwestionariuszy u kobiet z rozpoznaną fibromialgią i łagodną nadwagą/otyłością.

Celami drugorzędnymi są: ocena wpływu interwencji dietetycznej na pomiary antropometryczne, parametry metaboliczne i skład ciała uczestników; ocena wpływu interwencji dietetycznej na skład mikrobiomu jelitowego poprzez analizę metabolomiczną; oraz pomiar poziomów neurosteroidów o dodatniej aktywności allosterycznej w receptorach GABA-A lub NMDA w ślinie i/lub osoczu. Dodatkowo, eksploracyjne badanie pilotażowe ma na celu pomiar poziomów GABA i glutaminianu w mózgu za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego w małej podgrupie pacjentów.

Uczestnicy tego badania będą rekrutowani z poradni ambulatoryjnych Oddziału Reumatologii w szpitalu IRCCS Policlinico San Martino w Genui. Biorąc pod uwagę wysoką częstość występowania FM u kobiet, próba badawcza obejmie dorosłe pacjentki z rozpoznaną fibromialgią i łagodną nadwagą/otyłością.

Każda pacjentka zakwalifikowana do badania będzie samodzielnie wypełniała, w Oddziale Reumatologii, zestaw zwalidowanych kwestionariuszy zaprojektowanych do dokładnej oceny nasilenia FM, ze szczególnym uwzględnieniem następujących objawów: ból, jakość snu, depresja, lęk i funkcjonowanie jelit. Pacjentki będą proszone o wypełnienie kwestionariuszy przy rekrutacji/bazowo, co cztery tygodnie podczas wizyt kontrolnych zgodnie z protokołem badania oraz na końcu interwencji (12 tydzień).

Kwestionariusze obejmują Wskaźnik Bólu Rozpowszechnionego (WPI) i Skalę Nasilenia Objawów (SSS), oba używane w diagnozowaniu FM, a także Kwestionariusz Wpływu Fibromialgii (FIQR). FIQR ocenia jakość życia pacjentów, w tym funkcjonowanie fizyczne, ogólny wpływ choroby i objawy. Jest to najczęściej używany kwestionariusz w badaniach i praktyce klinicznej do szacowania nasilenia choroby, a minimalna klinicznie istotna różnica została zdefiniowana jako 14% redukcja wyniku.

Aby dalej badać ból, zostanie zastosowana 11-punktowa Numeryczna Skala Oceny do oceny średniego ogólnego natężenia bólu w ciągu ostatnich 24 godzin. Kwestionariusz PainDETECT (PD-Q) oceni typ i charakterystykę bólu, szczególnie celując w komponenty neuropatyczne/nociplastyczne, zwłaszcza u pacjentów z przewlekłym bólem.

Lęk i depresja będą oceniane za pomocą Szpitalnej Skali Lęku i Depresji (HADS), która zawiera 7 pozycji dotyczących lęku i 7 dotyczących depresji, dając dwa niezależne wyniki: HADS-A i HADS-D. Jakość snu będzie oceniana za pomocą Indeksu Jakości Snu w Pittsburghu (PSQI), który ocenia latencję snu, czas trwania, wydajność i zaburzenia.

Aby zidentyfikować czynnościowe zaburzenia żołądkowo-jelitowe, w szczególności zespół jelita drażliwego (IBS), zostaną zastosowane kryteria rzymskie IV i Brystolska Skala Form Stolca, która klasyfikuje formę i konsystencję stolca.

Podczas wizyty T0 zostaną zebrane wszystkie dane kliniczne niezbędne do oceny badania, w tym informacje socjodemograficzne, przestrzeganie diety śródziemnomorskiej (oceniane za pomocą zwalidowanego kwestionariusza PREDIMED), podstawowa przemiana materii obliczona za pomocą wzoru Mifflina, historia dietetyczna, kliniczna, rodzinna i medyczna, nawyki palenia, pomiar ciśnienia krwi oraz najnowsze wyniki badań laboratoryjnych.

Uczestnicy następnie przejdą pobranie krwi do rutynowych ocen laboratoryjnych zgodnie z praktyką kliniczną, z częścią próbki zarezerwowaną do analizy metabolomicznej. Metabolity będą ekstrahowane z próbek krwi za pomocą metanolu i MTBE do niecelowanego profilowania metabolomicznego, a MSK-QC-KIT zostanie dodany przed wstrzyknięciem do systemu UHPLC. Rozdział chromatograficzny zostanie przeprowadzony w warunkach C18 i HILIC. Dane spektrometrii mas będą uzyskiwane przy użyciu hybrydowego kwadrupol-Orbitrap Q Exactive Plus w trybie pełnego skanu, zarówno w jonizacji dodatniej, jak i ujemnej. Dane będą przetwarzane w celu dekonwolucji, wykrywania pików, wyrównania i identyfikacji związków. Próbka proceduralna pusta zostanie użyta do odejmowania tła i usuwania szumu podczas wstępnego przetwarzania. Adnotacja związków zostanie wykonana przy użyciu MS-FINDER wersja 3.26, a następnie analizy bioinformatyczne w celu wzbogacenia metabolitów i szlaków.

Rutynowe testy laboratoryjne będą przeprowadzane w laboratoriach Policlinico San Martino, podczas gdy niecelowana analiza metabolomiczna mikrobiomu jelitowego będzie wykonywana w laboratoriach uniwersyteckich DINOGMI (IRCCS Giannina Gaslini).

Wreszcie, uczestnicy będą również proszeni o dostarczenie próbek śliny, w których poziomy neuroaktywnych steroidów, takich jak kortyzol, progesteron i DHEA, będą mierzone za pomocą analizy ELISA. Ta analiza będzie przeprowadzana w laboratoriach uniwersyteckich DIFAR (UNIGE).

W ciągu następnych siedmiu dni odbędzie się wizyta w tej samej poradni ambulatoryjnej wyznaczonej przez Oddział Reumatologii, podczas której wyniki uzyskane w T0 zostaną omówione z uczestnikiem. Jeśli nie zostaną zidentyfikowane problemy związane z potencjalnymi niepowodzeniami w rekrutacji, uczestnicy przejdą do randomizacji i otrzymają swój plan dietetyczny od dedykowanego personelu w tej samej poradni, we współpracy z Oddziałem Dietetyki i Żywienia Klinicznego tego samego szpitala.

Podczas wizyty T1 uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do jednej z trzech grup dietetycznych: dieta ketogenna hipokaloryczna, dieta śródziemnomorska lub dieta śródziemnomorska suplementowana probiotykami. Następnie otrzymają odpowiedni plan dietetyczny, wraz ze szczegółowymi instrukcjami zarówno na piśmie, jak i podczas indywidualnej konsultacji. Nie oczekuje się działań niepożądanych z proponowanych planów dietetycznych, z wyjątkiem diety ketogennej, gdzie rzadkie działania niepożądane są przejściowe i mogą obejmować nudności, wymioty, przejściową letargię, anoreksję, hipoglikemię, odwodnienie, kwasicę, zaparcia, wzdęcia brzucha, ból głowy i zmęczenie.

Wykonane zostaną pomiary antropometryczne, w tym masa ciała, wzrost, obliczenie wskaźnika masy ciała (BMI), obwód talii i stosunek talia-biodra. Analiza składu ciała może być wykonana za pomocą analizy bioimpedancji elektrycznej (BIA). Pomiary antropometryczne i próbki biologiczne będą ponownie zbierane podczas wizyt kontrolnych co cztery tygodnie i na końcu 12-tygodniowego okresu badania.

Dla badania pilotażowego, poziomy GABA i glutaminianu będą mierzone w określonych regionach mózgu za pomocą spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS). W tym celu podgrupa 18 pacjentek – 6 na grupę dietetyczną – zostanie wybrana do tej analizy i podpisze specyficzną formę świadomej zgody. Procedura zostanie wykonana dwukrotnie: po raz pierwszy w T1 w zależności od dostępności skanera, przed rozpoczęciem diety, i po raz drugi po 4 tygodniach.

Wyniki spektroskopii, skupiające się na poziomach GABA i glutaminianu u pacjentek, będą porównywane ze spektrami uzyskanymi od sześciu osób kontrolnych. Osoby kontrolne będą przesiewane pod kątem odległej i niedawnej historii medycznej w celu wykluczenia potencjalnej obecności jakichkolwiek patologii narządowo-specyficznych w czasie oceny przez neuroradiologa. Zgodnie z rutynową praktyką kliniczną, zostanie przeprowadzony kwestionariusz przedbadaniowy w celu oceny ewentualnych przeciwwskazań i zostanie podpisany zarówno przez nadzorującego neuroradiologa, jak i uczestnika. Nie zostanie podany środek kontrastowy.

Rekrutacja osób kontrolnych jest konieczna, ponieważ pomiar piku GABA-glutaminianu w regionach OUN jest trudny i złożony. Ustalenie bazowych poziomów GABA i glutaminianu u zdrowych osób kontrolnych jest niezbędne do porównania z pacjentkami z FM, które mogą wykazywać zmienione poziomy. Jeśli podczas badania MRS u osób kontrolnych lub pacjentek z FM zostanie podejrzewany jakikolwiek patologiczny wynik, neuroradiolog poinformuje osoby i zaleci pełne badanie MR morfologiczne, z kontrastem jeśli to konieczne.

Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) wykorzystuje fale radiowe zamiast promieniowania jonizującego, w przeciwieństwie do tomografii komputerowej, i przy odpowiednich sekwencjach, nie są obecnie znane żadne specyficzne ryzyka dla uczestników. Przetwarzanie danych będzie wykonane offline przy użyciu oprogramowania Gannet wersja 3, opracowanego do analizy danych 1H-MRS z pojedynczego woksela w celu pomiaru GABA i glutaminianu. Stężenia metabolitów będą wyrażone w jednostkach instytucjonalnych, względem wody, z czynnikiem korekcyjnym pochodzącym z frakcji płynu mózgowo-rdzeniowego w wokselu. Oprogramowanie umożliwia korejestrację obrazu strukturalnego z wokselem i segmentację na trzy główne typy tkanek w celu obliczenia tego czynnika korekcyjnego. Zmiany w stężeniach metabolitów między T0 a T4 będą obliczane względem wartości wyjściowych, a wartości T4 będą porównywane z wartościami średnimi osób kontrolnych.

Użyty skaner MRI będzie 3T Prisma Siemens, dostępny w Oddziale Neuroradiologii i rutynowo używany zarówno do celów klinicznych, jak i badawczych. Sekwencja MEGA-PRESS, zawarta w protokołach akwizycji, będzie używana do tego typu pomiarów. Dwa woksele – 30 × 30 × 30 mm³ – zostaną umieszczone: jeden w lewym wzgórzu i jeden w lewej korze somatosensorycznej ciemieniowej. Regiony te zostały wybrane jako reprezentatywne dla kory sensorycznej i struktur przekaźnikowych wzgórza, odzwierciedlających szlaki sensoryczne, w tym przetwarzanie bólu. Dodatkowo, dwie sekwencje obrazowania strukturalnego, T1-MPRAGE 3D i FLAIR-3D, zostaną pozyskane do analizy danych.

Kryteria włączenia

• Dorosłe pacjentki z rozpoznaną fibromialgią, w wieku ≤ 65 lat, z nadwagą lub otyłością I stopnia (24,9 < BMI ≤ 34,9 kg/m²).
• Pacjentki zdolne do samodzielnego udzielenia pisemnej świadomej zgody na udział w badaniu.
• Pacjentki zmotywowane do udziału w badaniu i zdolne do samodzielnego zarządzania planami dietetycznymi.

Kryteria wykluczenia

• Brak podpisanej świadomej zgody.
• Wiek < 18 lub > 65 lat.
• Płeć męska.
• Pacjenci z alergiami pokarmowymi lub celiakią, cukrzycą typu 1 lub autoimmunologicznymi postaciami cukrzycy, lub ciężką dysfunkcją komórek beta trzustki; pacjenci leczeni inhibitorami SGLT2; osoby z niedawnymi zdarzeniami sercowo-naczyniowymi lub mózgowo-naczyniowymi, niewydolnością wątroby, umiarkowaną lub ciężką niewydolnością nerek, niewydolnością oddechową, epizodami dny moczanowej, kamieniami nerkowymi, zaburzeniami elektrolitowymi, niewydolnością serca NYHA III-IV, niestabilną dławicą piersiową, zaburzeniami rytmu serca lub zawałem mięśnia sercowego w ciągu ostatnich 12 miesięcy; ciężka depresja lub inne zaburzenia psychiatryczne; nadużywanie leków, narkotyków lub alkoholu; pacjenci w stanie kruchości; ciąża lub karmienie piersią; pacjenci planowani do operacji lub procedur inwazyjnych; rzadkie zaburzenia metaboliczne, takie jak porfiria, niedobór karnityny, niedobór karnityno-palmitylo-transferazy, niedobór karnityno-acylokarnityno-translokazy, niedobór karboksylazy pirogronianowej lub zaburzenia beta-oksydacji mitochondrialnej; pacjenci na terapii diuretykami.
• Stosowanie prebiotyków i/lub probiotyków nieokreślonych przez badanie lub innych suplementów diety w ciągu miesiąca przed rekrutacją.
• Leczenie antybiotykami w ciągu 3 miesięcy przed rekrutacją.
• Aktywne infekcje w czasie rekrutacji lub jakiekolwiek przewlekłe zaburzenia żołądkowo-jelitowe (np. choroba Leśniowskiego-Crohna).
• Znaczne problemy z jedzeniem (np. dysfagia). Dodatkowe kryteria wykluczenia dla MRI
• Implantowane urządzenia metalowe (np. rozruszniki serca).
• Rozmiar głowy, szyi lub ciała niezgodny ze skanerem MRI.
• Obecność kolczyków lub silna klaustrofobia. Próba badawcza
• 90 pacjentek: 30 przydzielonych do diety ketogennej (VLCKD), 30 do diety śródziemnomorskiej (MD) i 30 do diety śródziemnomorskiej suplementowanej probiotykami (MDP). Oczekuje się 10% wskaźnika wypadów na podstawie literatury dotyczącej leczenia fibromialgii i interwencji dietetycznych.

Badanie pilotażowe

• 18 pacjentek, 6 na grupę dietetyczną, zostanie włączonych do analizy MRS.

Czas trwania badania i oceny

• Każda pacjentka przejdzie 12-tygodniową interwencję dietetyczną.
• Ocena wyjściowa w T0, randomizacja i dostarczenie planu dietetycznego w T1.
• Wizyty kontrolne w 4, 8 i 12 tygodniu (T4, T8, T12).
• Opcjonalne kontakty telefoniczne w 2 lub 6 tygodniu (T2 lub T6) jeśli to konieczne.

Dieta śródziemnomorska: Zostanie zapewniona hipokaloryczna dieta śródziemnomorska 1400 kcal/dzień. Rozkład makroskładników będzie zgodny z włoskimi referencyjnymi poziomami spożycia składników odżywczych i energii (LARN, 5. wydanie): 0,8–1,2 g/kg masy ciała dla białka, 45–60% kalorii z węglowodanów i 20–35% z lipidów. Dzienne przydziały kaloryczne będą: 15% na śniadanie, 35–40% na obiad, 30–35% na kolację, a pozostałe 10% podzielone na dwie przekąski. Każda uczestniczka będzie stosować dietę śródziemnomorską przez całe 12-tygodniowe interwencje, z dostosowaniami w razie potrzeby, aby zapewnić przestrzeganie.

Bardzo niskokaloryczna dieta ketogenna (VLCKD):

VLCKD jest reżimem dietetycznym niskowęglowodanowym, o obniżonej kaloryczności, zapewniającym odpowiednią ilość białka. Jego mechanizm opiera się na produkcji ciał ketonowych, używanych jako alternatywne źródło energii do glukozy. Ketoza występuje, gdy spożycie węglowodanów jest ekstremalnie niskie, zmuszając organizm do mobilizacji tłuszczu na energię. VLCKD okazała się skuteczna w szybkiej utracie masy ciała u osób otyłych, które nie odniosły sukcesu w innych interwencjach dietetycznych, i jest uwzględniona jako opcja terapeutyczna w wytycznych leczenia otyłości. Ostatnie dowody sugerują dodatkowe korzyści dotyczące nastroju, funkcji poznawczych, nocycepcji i jakości snu.

W tym badaniu uczestniczki otrzymają zestawy żywnościowe przygotowane przez SDM (Grupa Pronokal), zapewniające wszystkie posiłki i suplementy witaminowe wymagane dla równowagi żywieniowej i przestrzegania VLCKD. Interwencja składa się z trzech faz:

• Faza I – „Atak” w ciągu 4 tygodni: 800 kcal/dzień, 1,2 g/kg idealnej masy ciała białka, 10–15 g lipidów, 45–70 g węglowodanów; dzienna suplementacja obejmuje 2 bs/dzień multiwitamin UNICOMPLEX, 3–4 posiłki PronoKal, 2 łyżki stołowe oleju i warzywa niskoskrobiowe (np. boćwina, brokuły, kalafior, cykoria, brokuły raab, cukinia, kozłek).

• Faza II – Przejście w ciągu 4 tygodni: Stopniowe ponowne wprowadzanie węglowodanów, zwiększone spożycie kalorii i zmniejszone użycie produktów PronoKal; 1 bs/dzień UNICOMPLEX jest utrzymywany. Stopniowe wprowadzanie:

  1. Tydzień 1 – owoce i zboża na śniadanie (+150 kcal)
  2. Tydzień 2 – nabiał i zboża na obiad (+150 kcal)
  3. Tydzień 3 – rośliny strączkowe (+150 kcal)
  4. Tydzień 4 – zwiększenie kalorii z wcześniej wprowadzonych pokarmów (+150 kcal)
• Faza III – Utrzymanie w ciągu 4 tygodni: Hipokaloryczna dieta w stylu śródziemnomorskim 1400 kcal/dzień, kończąca 12-tygodniową interwencję.

Trzecia grupa 30 uczestników będzie stosować spersonalizowaną dietę śródziemnomorską, jak opisano powyżej, wzbogaconą probiotykami wytwarzającymi GABA, np. Bifidobacterium adolescentis PRL2019 (20 CFU/dzień) przez 12 tygodni.

Wielkość próby: Dla głównego badania, wielkość próby została oszacowana na podstawie testu FIQ. Oczekiwane różnice między wartościami wyjściowymi a leczeniem wynosiły 12 punktów dla najlepiej działającej interwencji, i 8 oraz 6 punktów dla pozostałych dwóch, z założonym odchyleniem standardowym wewnątrzgrupowym 7, istotnością α = 0,05 i mocą 1–β = 0,8. To dało łączną n = 81. Aby uwzględnić 10% wypadów, zostanie zrekrutowanych 30 pacjentek na ramię, łącznie n = 90.

Ze względu na ograniczoną dostępność skanera, analiza MRI będzie badaniem pilotażowym, powszechnym do oceny wykonalności bez formalnych obliczeń mocy. Trzy grupy, po jednej na ramię interwencyjne, po n = 6 pacjentek każda, przejdą pomiary MR w T1 i T4 w Oddziale Neuroradiologii, Policlinico San Martino. Dane będą porównywane z pojedynczymi pomiarami MR od dopasowanych osób kontrolnych.

Analiza statystyczna będzie przeprowadzona przy użyciu IBM SPSS Statistics wersja 25 i R wersja 4.3.3, w zależności od wymagań statystycznych. Założenie normalności dla każdej zmiennej będzie oceniane za pomocą testu Shapiro-Wilka. Zmienne ciągłe będą raportowane jako mediana i zakres międzykwartylowy lub średnia ± odchylenie standardowe, w zależności od tego, czy podążają za rozkładem normalnym. Zmienne porządkowe i nominalne będą podsumowane w tabelach kontyngencji pokazujących częstotliwości i procenty w populacji badanej.

Porównania zmiennych ciągłych i porządkowych między grupami pacjentów będą wykonane za pomocą parametrycznych lub nieparametrycznych testów różnic średnich, w zależności od wielkości grup, lub analizy wariancji (ANOVA). Zmienne nominalne będą analizowane w tabelach kontyngencji przy użyciu testu chi-kwadrat Pearsona (χ²) lub dokładnego testu Fishera. W szczególności, dla wyników kwestionariuszy, skuteczność leczenia będzie oceniana poprzez ocenę różnic w wynikach przed-po między grupami i ich odchyleń standardowych w celu obliczenia wielkości efektu. Istotność statystyczna będzie oceniana przy użyciu modeli ANOVA (parametrycznych lub nieparametrycznych, w zależności od przypadku).

Metabolity wykazujące istotne różnice między grupami będą identyfikowane za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya HSD na podstawie progu wartości p. Zmiany w poziomach metabolitów będą wizualizowane przy użyciu pakietu EnhancedVolcano wersja 1.12.0. Różnice w poziomach cytokin i chemokin będą oceniane za pomocą ANOVA i testu t-Studenta. Wartość p ≤ 0,05 będzie uważana za wskazującą na statystycznie istotną różnicę między grupami.