Comparação da resposta imune específica do papilomavírus humano (HPV) tipo 16 E7 entre uma população normal e pacientes com lesões cervicais

HPV e câncer cervical:

Os papilomavírus humanos (HPV) são pequenos vírus de DNA não envelopados que induzem tumores epiteliais da pele ou mucosa. A maioria dos tumores é benigna, apresenta crescimento limitado e geralmente regride espontaneamente. No entanto, vários papilomavírus humanos induzem tumores que podem eventualmente progredir para carcinomas. Os tipos genitais de HPV 16 e 18, e menos freqüentemente os tipos 31, 33, 35, 45, 51 e 56, têm sido implicados na etiologia do câncer cervical e outros cânceres anogenitais. Aproximadamente 500.000 mulheres em todo o mundo desenvolvem câncer cervical anualmente e é a segunda principal causa de morte por câncer em mulheres. Nos países desenvolvidos, o câncer do colo do útero está atrás dos cânceres de mama, pulmão, útero e ovários e representa 7% de todos os cânceres femininos. Nos Estados Unidos, ocorrem cerca de 4.800 mortes anualmente por câncer do colo do útero. As evidências que ligam os HPVs ao câncer anogenital vêm de estudos epidemiológicos e laboratoriais. Mais de 90% dos cânceres cervicais e seus precursores, as chamadas neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC), contêm sequências de DNA do papilomavírus humano (HPV). Os tipos de HPV encontrados nas células cancerígenas têm atividade transformadora em estudos in vitro e as proteínas virais transformadoras, E6 e E7, são consistentemente expressas em linhagens celulares de câncer cervical e em pacientes com cânceres associados ao HPV. Na transformação maligna associada ao HPV, o DNA viral pode ser integrado ao DNA celular e a integração geralmente resulta na deleção de grandes setores do genoma viral. Genes tardios (L1 e L2) e alguns genes precoces (E1 e E2) geralmente são perdidos, deixando E6 e E7 como os únicos quadros de leitura abertos frequentemente encontrados em carcinomas. É provável que a expressão de E6 e E7 supere a regulação da proliferação celular normalmente mediada por proteínas como p53 e Rb, permitindo o crescimento descontrolado e proporcionando o potencial de transformação maligna.

Proteínas oncogênicas do HPV, E6 e E7, como alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para neoplasias cervicais associadas ao HPV:

E6 e E7 representam alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para malignidades associadas ao HPV. Primeiro, mais de 90% dos cânceres cervicais foram associados a HPVs, particularmente o tipo 16, e E6 e E7 são consistentemente expressos na maioria dos cânceres cervicais. Em segundo lugar, enquanto a maioria dos antígenos específicos do tumor são derivados de proteínas normais ou proteínas mutantes, E6 e E7 são proteínas virais completamente estranhas e potencialmente podem abrigar mais peptídeos/epítopos antigênicos do que uma proteína mutante (ou seja, p53) ou uma proteína embrionária reativada (i.e. MAGE-1). Em terceiro lugar, uma vez que E6 e E7 são necessários para a indução e manutenção de fenótipos malignos de células cancerígenas, as células de câncer cervical não podem escapar de uma resposta imune através da perda de antígeno. Sem E6 e E7 funcionais, essas células deixariam de ser tumorigênicas. Portanto, as proteínas E6 e E7 representam alvos ideais para o desenvolvimento de imunoterapias específicas para antígenos ou vacinas para o câncer cervical.

Várias formas de vacinas, como vacinas baseadas em vetores, vacinas baseadas em tumores, vacinas baseadas em DNA e vacinas baseadas em proteínas/peptídeos, foram descritas em sistemas experimentais direcionados às proteínas E6 e/ou E7 do HPV-16. Por exemplo, Meneguzzi et al. relataram que a inoculação de ratos com recombinantes de vaccinia expressando HPV-16 E6 ou E7 retardou ou impediu o desenvolvimento de tumores em 25-47% dos ratos desafiados com uma linha celular tumorigênica de rato co-transfectada com HPV-16 e ras ativado. Além disso, Chen et al. demonstraram que a imunização de camundongos com células não tumorigênicas singênicas transfectadas com o gene HPV-16 E7 confere proteção contra células tumorais singênicas positivas para HPV-16 E7 transplantadas. Feltkamp et ai. identificaram um epítopo CTL no HPV-16 E7 usando estudos de ligação de peptídeos H-2Kb e H-2Db MHC classe I. A imunização com este peptídeo tornou os camundongos resistentes a um desafio com células tumorais transformadas por HPV-16. Além disso, as partículas quiméricas semelhantes ao papilomavírus (CVLPs) consistem em proteínas quiméricas HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., comunicação pessoal) ou HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., comunicação pessoal). como vacinas terapêuticas contra tumores expressando HPV-16 E7 em modelos murinos. Mais recentemente, um ensaio clínico de fase I/II foi realizado em oito pacientes com câncer cervical em estágio avançado usando um vírus vaccinia recombinante vivo expressando as proteínas E6 e E7 dos HPV 16 e 18 (TA-HPV). Nesse estudo, não foram observados efeitos colaterais clínicos significativos ou contaminação ambiental por TA-HPV vivo.

Importância das respostas imunes mediadas por células no controle de infecções por HPV e neoplasias associadas ao HPV:

Várias linhas de evidência sugerem que as respostas imunes mediadas por células são importantes no controle tanto das infecções por HPV quanto das neoplasias associadas ao HPV. Primeiro, a prevalência de doenças relacionadas ao HPV (infecções e neoplasias) é aumentada em receptores de transplantes e pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), ambos os quais são conhecidos por terem imunidade mediada por células prejudicada. Em segundo lugar, estudos em animais demonstraram que os animais imunizados são protegidos da infecção pelo papilomavírus e do desenvolvimento de neoplasias. A imunização também facilita a regressão das lesões existentes. Em terceiro lugar, foram observadas células T infiltrantes CD4+ (células T auxiliares) e CD8+ (células T citotóxicas/supressoras) em verrugas com regressão espontânea e, em quarto lugar, verrugas em pacientes que estão em terapia imunossupressora geralmente desaparecem quando esse tratamento é descontinuado.

Respostas imunes celulares ao HPV:

A compreensão da imunidade mediada por células T para infecções por HPV foi facilitada pela identificação de epítopos MHC classe I e classe II de proteínas de HPV. Vários grupos tentaram mapear epítopos de células T helper (Th) murinas e humanas em proteínas de HPV. Vários grupos também tentaram mapear epítopos de linfócitos T citotóxicos (CTL) murinos e humanos em proteínas de HPV. Kast et ai. identificaram vários peptídeos de ligação de alta afinidade das proteínas E6 e E7 do HPV-16 para alelos HLA-A humanos. Além disso, CTLs específicos do HPV que reconhecem as proteínas E6 e E7 do HPV foram demonstrados no sangue periférico de pacientes com câncer cervical, em doadores saudáveis ​​e em pacientes com lesões CIN [Nakagawa, 1997 #562]. Além disso, a infiltração de tecido de câncer cervical com CTLs específicos de HPV foi recentemente descrita.

As respostas imunes mediadas por células em lesões infectadas por HPV podem ser demonstradas por testes cutâneos in vivo, ensaios CTL in vitro e respostas linfoproliferativas in vitro. Por exemplo, Hopfl et al. usaram proteínas de HPV-16 expressas em bactérias para testes cutâneos em pacientes com lesões de NIC e encontraram respostas cutâneas específicas à proteína L1 do vírion e não à proteína E4. Em pacientes com lesões de NIC, CTLs específicos de HPV foram identificados em PBMC e em tecidos cervicais. As respostas linfoproliferativas in vitro em pacientes com lesões de NIC têm sido ativamente investigadas. Por exemplo, de Gruijl et al. relataram que as respostas proliferativas de células T contra a proteína oncogênica E7 do HPV-16 foram mais proeminentes em pacientes com NIC com infecção persistente por HPV. No entanto, Kadish et al. relataram que as respostas linfoproliferativas aos peptídeos E6 e E7 específicos do HPV-16 pareciam estar associadas à eliminação da infecção pelo HPV e à regressão das lesões de NIC.

Importância das funções das células T auxiliares na geração de respostas antitumorais eficazes:

Evidências crescentes sugerem que respostas antitumorais inadequadas podem resultar de uma falha do braço auxiliar da resposta imune. Os eventos que levam à ativação de CTL são estritamente regulados para proteger contra o desenvolvimento de respostas imunes inadequadas a antígenos próprios ou respostas exageradas a antígenos estranhos. Essa regulação é mediada por linfocinas produzidas pelas células auxiliares T CD4+. As células auxiliares T CD4+ são críticas para a geração de potentes respostas imunes antitumorais. Demonstrou-se que as células T CD4+ são instrumentais na geração de respostas imunes contra várias malignidades sólidas em murinos [Fearon, 1990 #833; Golumbek, 1991 #834] e em populações humanas [Topalian, 1994 #396; Topalian, 1994 #397]. Vários tumores de camundongos que são transfectados com genes MHC de classe II singênicos tornam-se vacinas muito eficazes contra o desafio subsequente com tumores negativos de classe II de tipo selvagem [Ostrand-Rosenberg, 1990 #177; James, 1991 #272; Chen, 1993 #213] Além disso, como células de memória cruciais no braço de células T do sistema imunológico, as células CD4+ podem ser capazes de fornecer imunidade de longo prazo contra antígenos específicos [Tew, 1990 #624; Sprent, 1994 #625].

Papel das citocinas na imunidade mediada por células:

A imunidade mediada por células é regulada por citocinas que são secretadas por células T auxiliares. Em geral, as células T auxiliares podem ser classificadas como células Th1 e/ou Th2 com base nos diferentes tipos de citocinas que secretam. As células Th1 secretam interleucina (IL) 2 e interferon gama (IFN-gama). As células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Os linfócitos Th1 são as células efetoras mais importantes em reações inflamatórias associadas com vigorosa hipersensibilidade do tipo retardada, mas baixa produção de anticorpos, como ocorre na dermatite de contato e em infecções bacterianas virais ou intracelulares (para revisão, ver [Mosmann, 1989 #168; Romagnani, 1992 #130]). O fenótipo funcional da maioria das células Th2 pode explicar tanto a produção persistente de certos isotipos de anticorpos, particularmente IgG1 e IgE, quanto a eosinofilia observada em infecções helmínticas humanas e distúrbios alérgicos. Acredita-se que a proteção mediada por linfócitos contra infecções virais, bem como o controle de tumores, sejam mediados por respostas de citocinas Th1 e prejudicadas por respostas de citocinas Th2. É provável que a resposta Th1 produtora de IL-2 e IFN-gama seja o principal componente que contribui para o desenvolvimento da imunidade mediada por células contra infecções por HPV e neoplasias associadas ao HPV.

Vacinas quiméricas específicas para E7 podem controlar o modelo de tumor que expressa HPV16 E7. Ao cooperar com o Prof. TC Wu no Johns Hopkins Medical Institutes, desenvolvemos com sucesso várias vacinas quiméricas de DNA, RNA e vetores de vírus para prevenir e tratar tumores que expressam HPV16 E7 em modelos animais. Descobrimos que essas vacinas de DNA quimérico E7 são capazes de prevenir e tratar o crescimento de tumores modelo murino que expressam E7. Esses resultados positivos dos modelos murinos pré-clínicos nos encorajaram a focar no desenvolvimento de uma vacina contra o câncer e imunoterapia e aplicar essas vacinas em seres humanos.

No entanto, é muito importante estabelecer vários ensaios imunológicos específicos de E7 em seres humanos para avaliar o efeito de uma vacina contra o câncer ou imunoterapia em futuros ensaios clínicos. Portanto, gostaríamos de fornecer esta proposta para abordar o desenvolvimento de ensaios imunológicos específicos para HPV 16 E7 em seres humanos. Existem vários objetivos neste projeto:

1. desenvolver e utilizar ensaios para medir CTLs para proteínas HPV 16 E7, e
2. desenvolver e utilizar ensaios para medir as respostas T helper (Th) aos antígenos E7 do HPV 16.