Ihmisen papilloomaviruksen (HPV) tyypin 16 E7-spesifisen immuunivasteen vertailu normaalin väestön ja kohdunkaulan leesioita sairastavien potilaiden välillä

HPV ja kohdunkaulan syövät:

Ihmisen papilloomavirukset (HPV) ovat pieniä, vaipattomia DNA-viruksia, jotka indusoivat ihon tai limakalvon epiteelisuvaimia. Suurin osa kasvaimista on hyvänlaatuisia, niillä on rajallista kasvua ja yleensä ne taantuvat spontaanisti. Useat ihmisen papilloomavirukset indusoivat kuitenkin kasvaimia, jotka voivat lopulta edetä karsinoomiksi. Sukupuolielinten HPV-tyypit 16 ja 18 ja harvemmin tyypit 31, 33, 35, 45, 51 ja 56 ovat osallisina kohdunkaulan ja muiden anogenitaalien syöpien etiologiassa. Noin 500 000 naista maailmanlaajuisesti sairastuu kohdunkaulan syöpään vuosittain ja se on naisten toiseksi yleisin syöpäkuolemien syy. Kehittyneissä maissa kohdunkaulasyöpä sijoittuu rinta-, keuhko-, kohtu- ja munasarjasyöpien taakse ja muodostaa 7 % kaikista naisten syövistä. Yhdysvalloissa kohdunkaulan syöpään kuolee vuosittain noin 4 800 ihmistä. Todisteet HPV:n yhdistämisestä anogenitaaliseen syöpään ovat peräisin epidemiologisista ja laboratoriotutkimuksista. Yli 90 % kohdunkaulan syövistä ja niiden esiasteista, ns. kohdunkaulan intraepiteliaalinen neoplasia (CIN), sisältää ihmisen papilloomaviruksen (HPV) DNA-sekvenssejä. Syöpäsoluista löydetyillä HPV-tyypeillä on transformoivaa aktiivisuutta in vitro -tutkimuksissa, ja viruksen transformoivat proteiinit E6 ja E7 ilmentyvät johdonmukaisesti kohdunkaulan syöpäsolulinjoissa ja potilaiden HPV:hen liittyvissä syövissä. HPV:hen liittyvässä pahanlaatuisessa transformaatiossa virus-DNA voi integroitua solun DNA:han ja integraatio johtaa usein virusgenomin laajojen osien deleetioon. Myöhäiset geenit (L1 ja L2) ja jotkin varhaiset geenit (E1 ja E2) katoavat yleensä, jolloin E6 ja E7 ovat ainoita avoimia lukukehyksiä, joita esiintyy usein karsinoomissa. E6:n ja E7:n ekspressio voittaa todennäköisesti proteiinien, kuten p53:n ja Rb:n, normaalisti välittämän soluproliferaation säätelyn, mikä mahdollistaa hallitsemattoman kasvun ja tarjoaa mahdollisuuden pahanlaatuiseen transformaatioon.

HPV:n onkogeeniset proteiinit E6 ja E7 ihanteellisina kohteina kehitettäessä antigeenispesifisiä immuunihoitoja tai rokotteita HPV:hen liittyviin kohdunkaulan pahanlaatuisiin kasvaimiin:

E6 ja E7 edustavat ihanteellisia kohteita antigeenispesifisten immunoterapioiden tai rokotteiden kehittämiseen HPV:hen liittyviin pahanlaatuisiin kasvaimiin. Ensinnäkin yli 90 % kohdunkaulan syövistä on yhdistetty HPV:hen, erityisesti tyyppi 16, ja E6 ja E7 ilmenevät johdonmukaisesti useimmissa kohdunkaulan syövissä. Toiseksi, vaikka useimmat kasvainspesifiset antigeenit ovat peräisin normaaleista proteiineista tai mutatoiduista proteiineista, E6 ja E7 ovat täysin vieraita virusproteiineja, ja ne voivat sisältää mahdollisesti enemmän antigeenisiä peptidejä/epitooppeja kuin mutanttiproteiini (ts. p53) tai uudelleenaktivoitu alkioproteiini (ts. MAGE-1). Kolmanneksi, koska E6:ta ja E7:ää tarvitaan syöpäsolujen pahanlaatuisten fenotyyppien induktioon ja ylläpitoon, kohdunkaulan syövän solut eivät voi välttää immuunivastetta antigeenin häviämisen kautta. Ilman toimivaa E6:ta ja E7:ää nämä solut lakkaisivat olemasta tuumorigeenisiä. Siksi E6- ja E7-proteiinit ovat ihanteellisia kohteita kehitettäessä antigeenispesifisiä immunoterapioita tai rokotteita kohdunkaulan syöpää varten.

Erilaisia ​​rokotteiden muotoja, kuten vektoripohjaiset rokotteet, kasvainpohjaiset rokotteet, DNA-pohjaiset rokotteet ja proteiini/peptidipohjaiset rokotteet, on kuvattu kokeellisissa järjestelmissä, jotka kohdistuvat HPV-16 E6- ja/tai E7-proteiineihin. Esimerkiksi Meneguzzi et ai. raportoivat, että rottien rokotus rekombinanteilla vaccinia-aineilla, jotka ekspressoivat HPV-16 E6:ta tai E7:tä, hidasti tai esti kasvaimen kehittymistä 25-47 %:lla rotista, jotka oli altistettu kasvaimia synnyttävälle rotan solulinjalle, joka oli transfektoitu samanaikaisesti HPV-16:lla ja aktivoidulla ras:lla. Lisäksi Chen et ai. osoittivat, että hiirten immunisointi syngeenisillä ei-tuumorigeenisillä soluilla, jotka on transfektoitu HPV-16 E7 -geenillä, antaa suojan transplantoituja HPV-16 E7-positiivisia syngeenisiä kasvainsoluja vastaan. Feltkamp et ai. tunnisti CTL-epitoopin HPV-16 E7:ssä käyttämällä H-2Kb- ja H-2Db MHC-luokan I peptidin sitoutumistutkimuksia. Immunisointi tällä peptidillä teki hiirestä resistenttejä altistukselle HPV-16-transformoiduilla kasvainsoluilla. Lisäksi kimeeriset papilloomaviruksen kaltaiset hiukkaset (CVLP:t) koostuvat HPV-16 L1-E7 (Nieland et al., henkilökohtainen viestintä) tai HPV-16 L1/L2-E7 (Greenstone et al., henkilökohtainen viestintä) kimeerisistä proteiineista on käytetty. terapeuttisina rokotteina HPV-16 E7:tä ilmentäviä kasvaimia vastaan ​​hiiren malleissa. Äskettäin suoritettiin vaiheen I/II kliininen tutkimus kahdeksalla potilaalla, joilla oli myöhäisen vaiheen kohdunkaulansyöpä, käyttäen elävää rekombinanttivacciniavirusta, joka ilmentää HPV 16:n ja 18:n E6- ja E7-proteiineja (TA-HPV). Tässä tutkimuksessa ei havaittu merkittäviä kliinisiä sivuvaikutuksia tai elävän TA-HPV:n aiheuttamaa ympäristön kontaminaatiota.

Soluvälitteisten immuunivasteiden merkitys sekä HPV-infektioiden että HPV:hen liittyvien kasvainten hallinnassa:

Useat todisteet viittaavat siihen, että soluvälitteiset immuunivasteet ovat tärkeitä sekä HPV-infektioiden että HPV:hen liittyvien kasvainten hallinnassa. Ensinnäkin HPV:hen liittyvien sairauksien (infektiot ja kasvaimet) esiintyvyys lisääntyy elinsiirtojen vastaanottajilla ja HIV-tartunnan saaneilla potilailla, joilla molemmilla tiedetään olevan heikentynyt soluvälitteinen immuniteetti. Toiseksi eläintutkimukset ovat osoittaneet, että immunisoidut eläimet ovat suojassa papilloomavirusinfektiolta ja neoplasian kehittymiseltä. Rokotus helpottaa myös olemassa olevien leesioiden taantumista. Kolmanneksi tunkeutuvia CD4+- (T-auttajasoluja) ja CD8+- (sytotoksisia/suppressori-T-soluja) T-soluja on havaittu spontaanisti taantuvissa syyliissä ja neljänneksi, syylät potilailla, jotka saavat immunosuppressiivista hoitoa, usein häviävät, kun tämä hoito lopetetaan.

Solujen immuunivasteet HPV:lle:

T-soluvälitteisen immuniteetin ymmärtämistä HPV-infektioita vastaan ​​helpotti HPV-proteiinien MHC-luokan I ja luokan II epitooppien tunnistaminen. Useat ryhmät ovat yrittäneet kartoittaa hiiren ja ihmisen T-auttajasoluepitooppeja (Th) HPV-proteiineissa. Useat ryhmät ovat myös yrittäneet kartoittaa sekä hiiren että ihmisen sytotoksisia T-lymfosyyttien (CTL) epitooppeja HPV-proteiineissa. Kast et ai. ovat tunnistaneet useita korkean affiniteetin HPV-16 E6- ja E7-proteiinien sitoutumispeptidejä ihmisen HLA-A-alleeleille. Lisäksi HPV-spesifisiä CTL-soluja, jotka tunnistavat HPV E6- ja E7-proteiineja, on osoitettu kohdunkaulansyöpäpotilaiden ääreisveressä, terveillä luovuttajilla ja potilailla, joilla on CIN-leesioita [Nakagawa, 1997 #562]. Lisäksi äskettäin on kuvattu kohdunkaulan syöpäkudoksen infiltraatiota HPV-spesifisillä CTL:illä.

Soluvälitteiset immuunivasteet HPV-infektoituneissa leesioissa voidaan osoittaa in vivo ihotesteillä, in vitro CTL-määrityksillä ja in vitro lymfoproliferatiivisilla vasteilla. Esimerkiksi Hopfl et ai. ovat käyttäneet bakteerien ilmentymiä HPV-16-proteiineja ihotesteissä potilailla, joilla on CIN-leesioita, ja ovat löytäneet spesifisiä ihovasteita virioniproteiinille L1 eikä E4-proteiinille. Potilailla, joilla on CIN-leesioita, HPV-spesifisiä CTL-soluja on tunnistettu PBMC:ssä ja kohdunkaulan kudoksissa. In vitro lymfoproliferatiivisia vasteita potilailla, joilla on CIN-leesioita, on tutkittu aktiivisesti. Esimerkiksi de Gruijl et ai. raportoivat, että T-soluproliferatiiviset vasteet HPV-16 E7 onkogeenistä proteiinia vastaan ​​olivat näkyvimmät CIN-potilailla, joilla oli jatkuva HPV-infektio. Kuitenkin Kadish et ai. raportoivat, että lymfoproliferatiiviset vasteet spesifisille HPV-16 E6- ja E7-peptideille näyttivät liittyvän HPV-infektion puhdistumiseen ja CIN-leesioiden taantumiseen.

Auttaja-T-solutoimintojen merkitys tehokkaiden kasvainten vastaisten vasteiden luomisessa:

Yhä useammat todisteet ovat osoittaneet, että riittämättömät kasvainten vastaiset vasteet voivat johtua immuunivasteen auttajavarren epäonnistumisesta. Tapahtumat, jotka johtavat CTL:n aktivoitumiseen, ovat tiukasti säädeltyjä suojaamaan sopimattomien immuunivasteiden kehittymiseltä omia antigeenejä vastaan ​​tai liioiteltuja vasteita vieraita antigeenejä vastaan. Tätä säätelyä välittävät CD4+ T-auttajasolujen tuottamat lymfokiinit. CD4+ T-auttajasolut ovat kriittisiä voimakkaiden kasvaintenvastaisten immuunivasteiden synnyttämiselle. CD4+ T-solujen on osoitettu auttavan luomaan immuunivasteita useita kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia vastaan ​​hiiressä [Fearon, 1990 #833; Golumbek, 1991 #834] ja ihmispopulaatioissa [Topalian, 1994 #396; Topalian, 1994 #397]. Useista hiiren kasvaimista, jotka on transfektoitu syngeenisillä MHC-luokan II geeneillä, tulee erittäin tehokkaita rokotteita myöhempää altistusta vastaan ​​villityypin luokan II negatiivisilla kasvaimilla [Ostrand-Rosenberg, 1990 #177; James, 1991 #272; Chen, 1993 #213] Lisäksi CD4+-solut, jotka ovat tärkeitä muistisoluja immuunijärjestelmän T-soluhaarassa, voivat kyetä tarjoamaan pitkäaikaista immuniteettia spesifisiä antigeenejä vastaan ​​[Tew, 1990 #624; Sprent, 1994 #625].

Sytokiinien rooli soluvälitteisessä immuniteetissa:

Soluvälitteistä immuniteettia säätelevät sytokiinit, joita T-auttajasolut erittävät. Yleensä T-auttajasolut voidaan luokitella Th1- ja/tai Th2-soluiksi niiden erittämien erityyppisten sytokiinien perusteella. Th1-solut erittävät interleukiini (IL) 2:ta ja gamma-interferonia (IFN-gamma). Th2-solut tuottavat IL-4:ää, IL-5:tä, IL-10:tä ja IL-13:a. Th1-lymfosyytit ovat tärkeimmät efektorisolut tulehdusreaktioissa, jotka liittyvät voimakkaaseen viivetyyppiseen yliherkkyyteen mutta alhaiseen vasta-ainetuotantoon, kuten tapahtuu kosketusihottumissa ja virus- tai solunsisäisissä bakteeri-infektioissa (katso katsaus [Mosmann, 1989 #168; Romagnani, 1992 #130]). Useimpien Th2-solujen toiminnallinen fenotyyppi voi selittää sekä tiettyjen vasta-aineisotyyppien, erityisesti IgG1:n ja IgE:n, jatkuvan tuotannon että ihmisen helmintisissä infektioissa ja allergisissa sairauksissa havaitun eosinofilian. Lymfosyyttivälitteisen suojan virusinfektioilta sekä kasvainten hallinnan uskotaan välittyvän Th1-sytokiinivasteilla ja heikentävän Th2-sytokiinivasteilla. IL-2:ta ja IFN-gammaa tuottava Th1-vaste on todennäköisesti tärkein komponentti, joka myötävaikuttaa soluvälitteisen immuniteetin kehittymiseen HPV-infektioita ja HPV:hen liittyviä kasvaimia vastaan.

Kimeeriset E7-spesifiset rokotteet voivat hallita HPV16 E7:tä ilmentävää kasvainmallia. Tekemällä yhteistyötä Johns Hopkins Medical Institutesin professori TC Wun kanssa olemme menestyksekkäästi kehittäneet useita kimeerisiä DNA-, RNA- ja virusvektorirokotteita HPV16 E7:tä ilmentävien kasvainten ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi eläinmalleissa. Havaitsimme, että nämä E7-kimeeriset DNA-rokotteet kykenevät estämään ja hoitamaan E7:tä ilmentävien hiiren mallikasvaimien kasvua. Nämä prekliinisistä hiirimalleista saadut positiiviset tulokset ovat kannustaneet meitä keskittymään syöpärokotteen ja immunoterapian kehittämiseen ja soveltamaan näitä rokotteita ihmisiin.

On kuitenkin erittäin tärkeää laatia erilaisia ​​E7-spesifisiä ihmisille suunnattuja immunologisia määrityksiä syöpärokotteen tai immunoterapian vaikutuksen arvioimiseksi tulevissa kliinisissä kokeissa. Haluaisimme siis esittää tämän ehdotuksen käsitelläksemme HPV 16 E7 -spesifisten immunologisten määritysten kehittämistä ihmisillä. Tällä projektilla on useita tavoitteita:

1. kehittää ja käyttää määrityksiä HPV 16 E7 -proteiinien CTL:ien mittaamiseksi, ja
2. kehittää ja käyttää määrityksiä mittaamaan T-auttaja (Th) -vasteita HPV 16 E7 -antigeeneille.