Fenótipo do esperma e regiões diferencialmente metiladas (Epigenetics)

Um subconjunto de 10 homens com AGD encurtado (juntamente com um grupo de controle de 10 doadores férteis com AGD normal) será solicitado a fornecer até três amostras de sêmen, cada uma das quais será classificada com FACS em subpopulações com/sem fragmentação de DNA e em subpopulações com/sem descondensação da cromatina.

Os espermatozóides com DNA fragmentado serão separados por classificação FACS de espermatozóides com DNA intacto usando o corante YoPro 1, que demonstrou correlacionar-se significativamente com o grau de fragmentação do DNA nos núcleos do esperma.

Além disso, espermatozóides com remodelamento anormal da cromatina serão separados por triagem de espermatozóides com cromatina condensada usando o fluorocromo cromomicina A3 (CMA3), que compete por protamina pela ligação ao sulco menor do DNA correlacionando assim com a persistência de histonas nos núcleos espermáticos . Experiências-piloto demonstraram a correlação estreita e altamente significativa de CMA3 com a coloração de azul de anilina. A coloração com azul de anilina não é adequada para o experimento de triagem, pois requer a fixação dos espermatozóides. A classificação baseada em CMA3 pode ser realizada com espermatozóides vivos.

As amostras classificadas e anonimizadas serão enviadas congeladas em gelo seco para um laboratório da Universidade de Genebra para a avaliação das diferenças na impressão epigenética do DNA usando estudos de expressão do genoma inteiro.