Аберрантные сплайсинги из-за нестабильности микросателлитов при колоректальном раке: физиопатологическое и клиническое значение

WP1 — для выявления соединений экзон/интрон, на которые особенно влияют аберрантные события сплайсинга при MSI CRC. Сначала последовательности будут оцениваться на CNG с использованием программного обеспечения Illumina Pipeline CASAVA (консенсусная оценка последовательности и вариации). Эта программа преобразует показатели интенсивности в базовые вызовы, выравнивания с оценками качества и дополнительные форматы для последующего анализа, тем самым быстро преобразовывая данные в биологически значимую информацию. Затем отфильтрованные данные будут переданы на платформу CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, реж: А. де Рейнис) для анализа нашим экспертом по биоинформатике. Рабочий процесс Cufflinks будет использоваться для количественной оценки уровней экспрессии транскриптов в опухолях MSI. Это позволяет проводить сборку, обнаружение и дифференциальную экспрессию транскриптов на уровне транскрипта. Поскольку стандартный рабочий процесс Cufflinks не поддерживает обнаружение или количественную оценку слияния генов, в него будут включены несколько новых функций. Во-первых, SoapFuse будет использоваться для обнаружения точек разрыва слияния и прогнозирования последовательностей соединений слияния. Они будут интегрированы в эталонный геном человека и аннотацию генов из проекта Gencode, чтобы обеспечить комплексную интегрированную аннотацию характеристик генов для картирования сплайсинговых прочтений. Процесс интеграции INCa - PRTK 2014 17/51 будет соответствовать нескольким правилам, чтобы свести к минимуму возможность нарушения количественного определения уровня экспрессии в предстоящих анализах. С помощью нашего настроенного эталонного генома и аннотации TopHat, выравниватель, который поддерживает сплайс-соединение и картирование слияния генов, будет использоваться для картирования RNASeq. Затем запонки будут использоваться для поиска новых вариантов сплайсинга, включая новые изоформы с пропуском экзона.

Они будут интегрированы в аннотацию с помощью Cuffmerge. В зависимости от результатов выравнивания, полученных с помощью TopHat, будет применено несколько фильтров для удаления кандидатов низкого качества для сплайс-вариации и слияния генов, а также кандидатов, несовместимых с существующими аннотированными транскриптами. При необходимости чтения будут собраны AbySS, а затем совмещены с эталонным геномом с помощью BLAT, чтобы предоставить больше информации для уточнения аннотации. Это создаст сборку транскриптома, содержащую слияние генов с высокой степенью достоверности и события пропуска экзонов. Идентификация этих событий затем будет выполняться в отдельных образцах. Cuffdiff будет использоваться для анализа результата картирования, также основанного на этой сборке транскриптома, для вызова дифференциально экспрессируемых генов и транскриптов и для обнаружения дифференциальных изменений сплайсинга. Наконец, CummeRbund будет использоваться для интерпретации и визуализации результатов.

Надежность анализа РНК-секвенций будет проверена путем поиска транскриптов с аберрантным сплайсингом, о которых уже сообщалось при раке MSI (например, MRE11 и HSP110) и для точечных мутаций в кодирующих последовательностях генов-мишеней для MSI (например, TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) и в других связанных с раком генах, которые служат внутренним положительным контролем (например, КРАС, BRAF, TP53, PIK3CA). Стоит отметить, что этот проект является частью нескольких других, разработанных совместно с CIT-Ligue и направленных на определение характеристик MSI CRC с использованием технологий Omics. Важно отметить, что эти данные уже доступны для значительного числа образцов и, следовательно, могут быть использованы при необходимости.

Данные когорты пациентов с RNASeq будут всесторонне проанализированы для выявления повторяющихся аберраций сплайсинга (ожидается, что в основном это пропуск экзонов), которые возникают конкретно в опухолях MSI толстой кишки по сравнению с CRC MSS и соответствуют нормальной слизистой оболочке толстой кишки. Среди них исследование будет сосредоточено на аберрациях сплайсинга, которые возникают из-за MSI и которые влияют на экзоны с фланкирующим вышестоящим интроном, содержащим LNCR длиной ≥ 15 п.н., который расположен на расстоянии ≤ 6 п.н. предварительный список экзонов). Как указано выше, около 2000 генов человека содержат по крайней мере один интрон с LNCR очень близко к акцепторному сайту сплайсинга AG в месте соединения интрон-экзон. Приблизительно 100 генов человека могут быть затронуты повторяющимися и специфическими аберрантными событиями сплайсинга из-за MSI при CRC (в основном пропуск экзонов; выведено из экспериментов, проведенных на ограниченной серии клеточных линий CRC и первичных опухолей с использованием массивов экзонов; предварительные и неопубликованные результаты).

WP2 — исследовать функциональные связи между MSI и аберрантными событиями сплайсинга.

После анализа RNASeq потребуется подтверждение аберрантных событий сплайсинга из-за MSI с использованием другого методологического подхода, чтобы исключить ложноположительные события. Это будет достигнуто с помощью количественной INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR в реальном времени с использованием внутренних специфических зондов (Applied biosystems). Для каждого пропущенного экзона в предварительном списке экзонов RNASeqMSI будет разработана общая пара прямых и обратных праймеров, расположенных во фланкирующих экзонах.

Будут разработаны два внутренних зонда, расположенных либо внутри пропущенных экзонов, либо охватывающих фланкирующие экзоны в месте их соединения, чтобы обнаруживать нормальную или аберрантно сплайсированную мРНК соответственно. Он очень чувствителен, а также позволяет избежать ложноположительных сигналов из-за загрязнения геномной ДНК. Экзоны-кандидаты, которые будут сохранены, - это те, которые демонстрируют аберрантное и повторяющееся пропускание в клеточных линиях MSI CRC и первичных опухолях по сравнению с контрольными MSS CRC.

В соответствии с нашей рабочей гипотезой исследование затем определит, вызвана ли каждая подтвержденная аберрация сплайсинга MSI. Это будет достигнуто, как описано ранее для делеций T17 в интроне 8 HSP110, которые были идентифицированы специфически в MSI CRC и приводили к пропуску экзона 9. Вкратце, аллельные профили соседних интронных LNCR (см. выше) будут проанализированы с использованием генотипирования на основе флуоресценции в панели клеточных линий MSI и MSS CRC, а также в полной серии первичных опухолей MSI из когорты пациентов RNASeq и парных нормальных. слизистая (для оценки полиморфного статуса). Это будет выполнено с использованием того же метода, разработанного ранее в нашей лаборатории для анализа повтора ДНК HSP110 T17. После переноса продуктов ПЦР на генетический анализатор ABI 3100 со стандартами размера GS400HD ROX и полимером POP-7 (Applied Biosystems) программное обеспечение GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) будет использоваться для анализа следов LNCR с применением AFLP (Amplified Biosystems). Полиморфизм длины фрагмента). Следы будут считаться приемлемыми, если амплитуда пиков составляет от 100 до 6000 единиц флуоресценции. Сценарий MSI Perl был разработан для автоматического сравнения следов LNCR в нормальных и опухолевых образцах, что позволяет обнаруживать аберрантные пики LNCR, выходящие за пределы полиморфной зоны, наблюдаемой в нормальной популяции. Как и в случае с HSP110, ожидается (i) обнаружение соматических делеций/инсерций в некоторых кандидатах LNCR с использованием этого подхода и (ii) идентификация тех, чьи соматические изменения из-за MSI в значительной степени связаны с событиями, связанными с пропуском экзона в Уровень РНК (окончательный список экзонов MSI).

WP3 — для выявления событий сплайсинга и/или мутаций LNCR, имеющих клиническое значение у пациентов с MSI CRC. Клиническая значимость генов-кандидатов (окончательный список экзонов MSI) будет оцениваться с использованием многомерных моделей регрессии выживаемости для RFS (выживание без рецидивов). Количество событий сплайсинга-кандидатов и/или мутаций LNCR составляет приблизительно 100 (см. WP1 и WP2 выше), и в многомерных моделях будут учитываться другие известные клинические детерминанты, такие как стадия, лечение и возраст на момент постановки диагноза. Ложноположительные результаты являются одной из основных ловушек при выявлении потенциально релевантных маркеров среди десятков кандидатов. Поскольку количество (p) рассматриваемых ковариат будет того же порядка, что и количество индивидуумов, будет достигнута «многомерная установка». Следовательно, обычные алгоритмы для моделей регрессии выживания (например, coxph в R) не сможет оценить параметры и идентифицировать события, имеющие клиническое значение. В нашем анализе особого внимания требуют три основных методологических вопроса, особенно на алгоритмическом уровне.

WP3 будет разделен на два основных этапа, первый из которых касается сравнений и разработки статистических алгоритмов. После настройки алгоритмы будут запущены для определения прогностического биомаркера (биомаркеров), который включает события сплайсинга и/или мутации LNCR с клинической значимостью.

Многомерные регрессионные модели и алгоритмы лассо. На первом этапе будут рассматриваться только сплайсинговые мутации и клинические детерминанты в моделях регрессии выживания. В этом случае выбор переменных и оценка параметров будут проводиться с помощью алгоритма лассо (или эластичной сети) (см. Simon et al. для модели Cox и Gaiffas et al. для модели Aalen, оба реализованы в R).

В предыдущих публикациях было продемонстрировано, что пороговые значения приводят к максимальным различиям в выживаемости между группами пациентов с большими или малыми делециями в HSP110 T17 LNCR, а также с высокой или низкой экспрессией мутантной мРНК HSP110 из-за пропуска экзона 9 в INCa-PRTK. 2014 20/51 уровень мРНК. Поскольку другие события сплайсинга могут иметь такой же пороговый эффект, будут тщательно определены точки отсечки для 100 возможных событий сплайсинга. Даже в классической статистике определение точки отсечения представляет собой известную трудность из-за избыточного обнаружения. Как недавно было предложено в соответствующем контексте, «лассо с алгоритмом предварительной проверки» можно было бы адаптировать для включения определения точки отсечки в основной алгоритм.

Другие пункты. Отсутствующие данные будут обработаны путем множественного вменения с использованием методов ближайшего соседа или регрессии. В исследовании будут рассмотрены возможные взаимодействия с применением химиотерапии. В качестве последнего шага будут проведены оценки обучающей когорты (Сент-Антуан) для получения прогностического биомаркера, который будет включать события сплайсинга и/или мутации LNCR, имеющие клиническое значение. Этот биомаркер будет подтвержден в тестовой когорте (многоцентровой). Для определения биомаркера будет проведен бутстрап-анализ.

WP4 — Инициировать функциональные исследования ограниченного числа клинически значимых генов, связанных с раком, сплайсинг которых сильно нарушен в раковых клетках MSI, и разработать биологические инструменты для упрощения скрининга в будущих клинических анализах. Как указывалось ранее, было проведено предварительное исследование с использованием массивов экзонов в небольшой серии клеточных линий MSI CRC и первичных опухолей (неопубликовано). Это было проведено для оценки осуществимости, времени, стоимости, неблагоприятных факторов, размера эффекта (статистической изменчивости) и улучшения дизайна исследования перед выполнением настоящего полномасштабного исследовательского проекта. Функции 100 обнаруженных генов-кандидатов (некоторые из которых могут перекрываться с таковыми, идентифицированными при скрининге РНКсек) часто были связаны с процессами, связанными с раком, такими как макромолекулярный синтез (30%), пролиферативная способность клеток или гибель клеток (20%). лекарственная устойчивость (10%) и другие (WNT-путь, метастатический процесс, изменения в структуре хромосом). Ожидается, что в настоящем проекте будет выявлено несколько надежных сплайс-мутантов, управляемых MSI, которые клинически значимы (см. WP2 и WP3 выше). Эти мутанты могут иметь как онкогенные, так и антионкогенные функции, учитывая, что некоторые из них (такие как HSP110) могут продуцироваться на высоких уровнях, даже если они оказывают негативное влияние на опухолевые клетки (см. выше нашу функциональную гипотезу относительно ожидаемого пагубного влияния MSI на LNCR в КПР). В этом контексте функциональные исследования in vitro будут разработаны для характеристики онкогенного воздействия небольшого числа (n = 5) предполагаемых клинически значимых мутантов. Эти эксперименты будут основаны на временном молчании или сверхэкспрессии с использованием миРНК или плазмид и специального биологического считывания в клеточных моделях CRC, уже доступных в нашей лаборатории.

В зависимости от полученных результатов можно было бы запланировать дальнейшие исследования с использованием стабильно трансфицированных моделей CRC, ксенотрансплантированных голым мышам. Кроме того, план исследования по проверке биологических инструментов (например, антитела) для оптимизации будущего скрининга пациентов с использованием рутинных анализов, аналогичных нашей работе с HSP110 и мутантом HSP110DE9. Тканевые микроматрицы (ТМА) будут конструироваться из обычно подготовленных, фиксированных формалином и залитых парафином блоков, собранных ретроспективно INCa - PRTK 2014 21/51 в отделении патологии больницы Сент-Антуан. Будут взяты образцы неопластической ткани, включая фронт инвазии опухоли (от 3 до 6 образцов сердцевин тканей диаметром 0,6 мм). При наличии метастазов в парные лимфатические узлы также будут взяты образцы. Иммуногистохимия с антителами, созданными специально (по субконтракту) для распознавания белков-кандидатов дикого типа или мутантных белков, будет выполняться на ТМА. События пропуска экзонов в 2/3 случаев приводят к сдвигу рамки считывания и, таким образом, генерируют укороченные белки с иммуногенными аберрантными С-концевыми хвостами. Будут оцениваться корреляции между экспрессией белка и клинико-патологическими признаками, а также их прогностические и прогностические значения. Изображения слайдов ТМА будут записаны в виде цифровых файлов с высоким разрешением, и оценка каждого окрашивания будет проводиться двумя патологоанатомами.