Poikkeava silmukointi, joka johtuu mikrosatelliitin epästabiilisuudesta kolorektaalisyövässä: Fysiopatologinen ja kliininen vaikutus

WP1 - Tunnistaa eksoni/introniliitokset, joihin MSI CRC:n poikkeavat silmukointitapahtumat vaikuttavat erityisesti. Sekvenssit arvioidaan ensin CNG:ssä käyttämällä Illuminan Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) -ohjelmistoa. Tämä ohjelma muuntaa intensiteettipisteet peruskutsuiksi, laatupisteytetyiksi kohdistuksiksi ja lisämuodoiksi loppupään analyysiin, mikä muuttaa tiedot nopeasti biologisesti merkityksellisiksi tiedoiksi. Suodatetut tiedot siirretään sitten CIT-alustalle (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, ohjaaja: A. de Reynies) bioinformatiikka-asiantuntijamme analysoitavaksi. Kalvosinnapit-työnkulkua käytetään MSI-kasvainten transkription ilmentymistasojen kvantifiointiin. Tämä mahdollistaa transkription kokoamisen, löytämisen ja differentiaalisen ilmentämisen mittaukset transkriptitason resoluutiolla. Koska tavallinen kalvosinnappien työnkulku ei tue geenifuusiokehitystä tai kvantifiointia, siihen sisällytetään useita uusia ominaisuuksia. Ensinnäkin SoapFusea käytetään fuusion katkeamispisteiden havaitsemiseen ja fuusioliitossekvenssien ennustamiseen. Nämä integroidaan Gencode-projektin ihmisen referenssigenomiin ja geenimerkintöihin, jotta saadaan kattava, integroitu annotaatio geeniominaisuuksista silmukointilukemien kartoittamista varten. Integrointi INCa - PRTK 2014 17/51 prosessi noudattaa useita sääntöjä minimoidakseen mahdollisen häiriöiden ilmenemistason kvantifioinnin tulevissa analyyseissä. Räätälöidyt referenssigenomimme ja annotaatiomme, TopHat, kohdistaja, joka tukee silmukointiliitos- ja geenifuusiokartoitusta, käytetään RNASeq-kartoitukseen. Kalvosinnapeilla löydetään sitten uusia silmukointivariantteja, mukaan lukien uudet eksonit ohittavat isoformit.

Nämä integroidaan huomautukseen Cuffmergen avulla. Riippuen TopHatilla saaduista kohdistustuloksista, useita suodattimia käytetään poistamaan heikkolaatuiset silmukoitumisvariaatiota ja geenifuusiota koskevat ehdokkaat sekä ehdokkaat, jotka eivät ole yhteensopivia olemassa olevien kommentoitujen transkriptien kanssa. Tarvittaessa AbySS kokoaa lukemat ja kohdistaa sen sitten vertailugenomiin BLAT:lla saadakseen lisätietoja huomautuksen tarkentamiseksi. Tämä tuottaa transkriptikokoonpanon, joka sisältää korkean luotettavuuden geenifuusion ja eksonien ohitustapahtumat. Nämä tapahtumat tunnistetaan sitten yksittäisissä näytteissä. Cuffdiffia käytetään kartoitustuloksen analysointiin, myös tähän transkriptikokoonpanoon perustuen, differentiaalisesti ilmentyneiden geenien ja transkriptien kutsumiseen sekä differentiaalisen silmukointimuutosten havaitsemiseen. Lopuksi CummeRbundia käytetään tulosten tulkitsemiseen ja visualisointiin.

RNA-seq-analyysin luotettavuus varmistetaan etsimällä poikkeavasti silmukoituneita transkriptejä, jotka on jo raportoitu MSI-syövissä (esim. MRE11 ja HSP110) sekä pistemutaatiot MSI:n kohdegeenien koodaavissa sekvensseissä (esim. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) ja muissa syöpään liittyvissä geeneissä, jotka toimivat sisäisinä positiivisina kontrolleina (esim. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). On syytä huomata, että tämä projekti on osa useita muita yhdessä CIT-Liguen kanssa kehitettyjä projekteja, joiden tarkoituksena on karakterisoida MSI CRC:tä Omics-teknologioiden avulla. Tärkeää on, että nämä tiedot ovat jo saatavilla huomattavasta määrästä näytteitä, joten niitä voitaisiin tarvittaessa hyödyntää.

Potilaiden RNASeq-kohortin tiedot analysoidaan kattavasti toistuvien silmukointipoikkeamien (oletetaan olevan enimmäkseen eksonien ohittamista) tunnistamiseksi, joita esiintyy erityisesti MSI-koolonkasvaimissa verrattuna MSS-CRC:hen ja vastaavaan normaaliin paksusuolen limakalvoon. Näistä tutkimuksessa keskitytään MSI:n aiheuttamiin silmukointipoikkeamiin, jotka vaikuttavat eksoneihin, joiden vieressä on ylävirran introni, joka sisältää ≥ 15 emäsparin LNCR:n, joka sijaitsee ≤ 6 emäsparin päässä intronin ja eksonien liitoksesta (silmukoinnin vastaanottajakohta) (RNASeqMSI- eksonin esiluettelo). Kuten edellä mainittiin, noin 2 000 ihmisen geeniä sisältää vähintään yhden intronin, jonka LNCR on hyvin lähellä AG:n silmukointiakseptorikohtaa introni-eksoniliitoksessa. Noin 100 ihmisen geeniä voivat vaikuttaa toistuviin ja spesifisiin poikkeaviin silmukointitapahtumiin, jotka johtuvat MSI:stä CRC:ssä (enimmäkseen eksonien ohittaminen; päätelty kokeista, jotka suoritettiin rajoitetulla sarjalla CRC-solulinjoja ja primäärisiä kasvaimia käyttäen eksoniryhmiä; alustavat ja julkaisemattomat tulokset).

WP2 - Tutkia toiminnallisia yhteyksiä MSI:n ja poikkeavien silmukointitapahtumien välillä.

RNASeq-analyysin jälkeen vaaditaan MSI:n aiheuttamien poikkeavien silmukointitapahtumien vahvistaminen käyttämällä toista metodologista lähestymistapaa väärien positiivisten tapahtumien eliminoimiseksi. Tämä saavutetaan reaaliaikaisella kvantitatiivisella INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR:llä käyttämällä sisäisiä, spesifisiä koettimia (Applied Biosystems). Jokaiselle ohitetulle eksonille RNASeqMSI-eksonien esiluettelossa suunnitellaan yhteinen pari eteenpäin ja käänteisiä alukkeita, jotka sijaitsevat viereisissä eksoneissa.

Suunnitellaan kaksi sisäistä koetinta, jotka sijaitsevat joko ohitettujen eksonien sisällä tai ylittävät vierekkäiset eksonit niiden risteyksessä normaalin tai poikkeavasti silmukoituneen mRNA:n havaitsemiseksi kilpailevalla tavalla, vastaavasti. Se on erittäin herkkä ja välttää myös vääriä positiivisia signaaleja, jotka johtuvat genomisen DNA:n kontaminaatiosta. Ehdokaseksonit, jotka säilytetään, ovat ne, joissa on poikkeavia ja toistuvia ohituksia MSI CRC -solulinjoissa ja primaarisissa kasvaimissa verrattuna MSS CRC -kontrolleihin.

Työhypoteesimme mukaisesti tutkimus määrittää sitten, onko jokainen vahvistettu silmukointipoikkeama MSI-ohjattu. Tämä saavutetaan, kuten on kuvattu aiemmin T17-deleetioiden osalta HSP110:n intronissa 8, jotka tunnistettiin spesifisesti MSI CRC:ssä ja jotka johtivat eksonin 9 ohittamiseen. Lyhyesti sanottuna viereisen intronisen LNCR:n alleeliprofiilit (katso edellä) analysoidaan käyttämällä fluoresenssipohjaista genotyypitystä MSI- ja MSS CRC-solulinjojen paneelissa sekä täydellisessä sarjassa MSI-primäärisiä kasvaimia RNASeq-potilaskohortista ja paritusta normaalista. limakalvo (polymorfisen tilan arvioimiseksi). Tämä suoritetaan käyttämällä samaa menetelmää, joka on kehitetty aiemmin laboratoriossamme HSP110 T17 -DNA-toiston analysointiin. Sen jälkeen kun PCR-tuotteet on siirretty ABI 3100 Genetic Analyzer -laitteessa, jossa on GS400HD ROX -kokostandardit ja POP-7-polymeeri (Applied Biosystems), GeneMapper V4.0 -ohjelmistoa (Applied Biosystems) käytetään LNCR-jälkien analysointiin AFLP:n (Amplified) avulla. Fragment Length Polymorphism) -menetelmä. Jäljet ​​katsotaan hyväksyttäviksi, kun huippuamplitudit ovat 100 - 6 000 fluoresenssiyksikköä. MSI Perl -skripti on kehitetty vertaamaan automaattisesti LNCR-jälkiä normaaleissa ja kasvainnäytteissä, mikä mahdollistaa poikkeavien LNCR-huippujen havaitsemisen, jotka jäävät normaalissa populaatiossa havaitun polymorfisen alueen ulkopuolelle. Kuten HSP110:n tapauksessa, odotetaan (i) havaitsevan somaattiset deleetiot/insertiot joissakin ehdokas-LNCR:issä tätä lähestymistapaa käyttämällä ja (ii) tunnistavan ne, joiden MSI:stä johtuvat somaattiset muutokset liittyvät merkittävästi eksonien ohitukseen liittyviin tapahtumiin RNA-taso (MSI-eksonien lopullinen luettelo).

WP3 - Tunnistaa silmukointitapahtumat ja/tai LNCR-mutaatiot, joilla on kliinistä merkitystä MSI CRC -potilailla. Ehdokasgeenien kliininen merkitys (MSI-eksonien lopullinen luettelo) arvioidaan käyttämällä RFS:n (relapse-Free Survival) monimuuttujaeloonjäämisregressiomalleja. Silmukointiehdokkaiden ja/tai LNCR-mutaatioiden määrä on noin 100 (katso WP1 ja WP2 yllä) ja INCa - PRTK 2014 19/51 muita tunnettuja kliinisiä tekijöitä, kuten vaihe, hoito ja ikä diagnoosin yhteydessä, otetaan huomioon monimuuttujamalleissa. Väärät positiiviset tulokset ovat yksi suurimmista sudenkuoppista mahdollisesti merkityksellisten merkkien tunnistamisessa kymmenien ehdokkaiden joukosta. Koska huomioon otettavien yhteismuuttujien lukumäärä (p) on samaa luokkaa kuin yksilöiden lukumäärä, saavutetaan "korkeaulotteinen asetus". Näin ollen tavanomaiset eloonjäämisregressiomallien algoritmit (esim. coxph in R) ei pysty arvioimaan parametreja ja tunnistamaan kliinistä merkitystä. Analyysissamme kolme pääasiallista metodologista kysymystä vaativat erityistä huomiota, erityisesti algoritmitasolla.

WP3 jaetaan kahteen päävaiheeseen, joista ensimmäinen koskee vertailuja ja tilastollisten algoritmien kehittämistä. Kun algoritmit on viritetty, ne ajetaan tunnistamaan prognostiset biomarkkerit, jotka sisältävät silmukointitapahtumia ja/tai LNCR-mutaatioita, joilla on kliinistä merkitystä.

Korkeadimensionaaliset regressiomallit ja lasso-algoritmit. Ensimmäisessä vaiheessa otetaan huomioon vain silmukointimutaatiot ja kliiniset determinantit eloonjäämisregressiomalleissa. Tässä tapauksessa muuttujien valinta ja parametrien estimointi suoritetaan lasso- (tai elastisen verkon) algoritmilla (ks. Simon et al. Cox-mallille ja Gaiffas ym. Aalen-mallille, molemmat toteutettu R:ssä).

Aiemmissa julkaisuissa on osoitettu, että raja-arvot johtivat maksimaalisiin eloonjäämiseroihin potilasryhmien välillä, joilla oli suuria tai pieniä deleetioita HSP110 T17 LNCR:ssä ja mutantti-HSP110-mRNA:n ekspressiota korkea tai alhainen johtuen eksonin 9 ohittamisesta INCa - PRTK:ssa. 2014 20/51 mRNA-taso. Koska muilla silmukointitapahtumilla voi olla sama kynnysvaikutus, jopa 100 ehdokkaan silmukointitapahtuman raja-arvot määritetään huolellisesti. Jopa klassisissa tilastoissa leikkauspisteen määritys on tunnettu vaikeus ylihavaitsemisen vuoksi. Kuten äskettäin samassa yhteydessä ehdotettiin, "lasso esiseulonta-algoritmilla" voitaisiin mukauttaa sisällyttämään leikkauspisteen määritys pääalgoritmiin.

Muut kohdat. Puuttuvat tiedot käsitellään useilla imputoinneilla lähin naapuri- tai regressiomenetelmistä. Tutkimuksessa tarkastellaan mahdollisia yhteisvaikutuksia kemoterapian käytön kanssa. Viimeisenä vaiheena suoritetaan arviot koulutuskohortilla (Saint-Antoine), jotta saadaan prognostinen biomarkkeri, joka sisältää silmukointitapahtumia ja/tai LNCR-mutaatioita, joilla on kliinistä merkitystä. Tämä biomarkkeri validoidaan testikohortissa (monikeskus). Bootstrap-analyysi suoritetaan biomarkkerin selvittämiseksi.

WP4 - Aloittaa toiminnalliset tutkimukset rajoitetulle määrälle kliinisesti merkittäviä, syöpään liittyviä geenejä, joiden silmukointi on erittäin häiriintynyt MSI-syöpäsoluissa, ja kehittää biologisia työkaluja seulonnan yksinkertaistamiseksi tulevissa kliinisissä määrityksissä. Kuten aiemmin todettiin, alustava tutkimus on suoritettu käyttämällä eksoniryhmiä pienessä sarjassa MSI CRC -solulinjoja ja primaarisia kasvaimia (julkaisematon). Tämä suoritettiin arvioidakseen toteutettavuutta, aikaa, kustannuksia, haitallisia tekijöitä, vaikutuksen kokoa (tilastollinen vaihtelu) ja parantaakseen tutkimussuunnitelmaa ennen tämän täysimittaisen tutkimusprojektin suorittamista. 100 havaitun ehdokasgeenin toiminnot (joista jotkin voivat olla päällekkäisiä RNAseq-seulonnassa tunnistettujen geenien kanssa) liittyivät usein syöpään liittyviin prosesseihin, kuten makromolekyylisynteesiin (30 %), solujen lisääntymiskykyyn tai solukuolemaan (20 %). lääkeresistenssi (10 %) ja muut (WNT-reitti, metastaattinen prosessi, muutokset kromosomirakenteessa). Tämän projektin odotetaan tunnistavan useita vankkoja MSI-ohjattuja silmukointimutantteja, jotka ovat kliinisesti merkittäviä (katso WP2 ja WP3 yllä). Näillä mutanteilla voi olla joko onkogeenisiä tai antionkogeenisiä toimintoja, koska jotkin (kuten HSP110) voivat muodostua korkeina määrinä, vaikka niillä on kielteisiä vaikutuksia kasvainsoluun (katso yllä oleva toiminnallinen hypoteesimme koskien MSI:n odotettua haitallista vaikutusta LNCR:ssä CRC). Tässä yhteydessä in vitro -toiminnalliset tutkimukset suunnitellaan luonnehtimaan pienen määrän (n = 5) oletettujen kliinisesti merkittävien mutanttien onkogeenisiä vaikutuksia. Nämä kokeet perustuvat ohimenevään vaimentamiseen tai yli-ilmentymiseen käyttämällä siRNA:ta tai plasmideja ja ad hoc -biologista lukemista CRC-solumalleissa, jotka ovat jo saatavilla laboratoriossamme.

Saatuista tuloksista riippuen voidaan suunnitella lisätutkimuksia käyttämällä stabiilisti transfektoituja CRC-malleja, jotka on siirretty nude-hiiriin. Lisäksi tutkimussuunnitelmassa validoidaan biologiset työkalut (esim. Vasta-aineet) potilaiden tulevan seulonnan optimoimiseksi rutiinimäärityksillä, samalla tavalla kuin työmme HSP110:n ja HSP110DE9-mutantin kanssa. Tissue Microarrays (TMA:t) rakennetaan rutiininomaisesti valmistetuista, formaliinilla kiinnitetyistä ja parafiiniin upotetuista lohkoista, jotka on kerätty takautuvasti Saint-Antoinen sairaalan patologian osastolta. Neoplastisesta kudoksesta otetaan näyte, mukaan lukien kasvaimen invasiivinen etuosa (3-6 näytettä halkaisijaltaan 0,6 mm:n kudosytimistä). Jos mahdollista, myös pariimusolmukkeiden etäpesäkkeistä otetaan näyte. Immunohistokemia vasta-aineilla, jotka on luotu spesifisesti (alisopimuksella) villityypin tai mutanttiehdokasproteiinien tunnistamiseksi, suoritetaan TMA:ille. Eksonin ohitustapahtumat ovat kehyssiirtymiä 2/3:ssa tapauksista ja muodostavat siten katkaistuja proteiineja, joilla on immunogeenisiä, poikkeavia C-pään hännät. Proteiinin ilmentymisen ja kliinis-patologisten piirteiden välisiä korrelaatioita sekä niiden prognostisia ja ennustavia arvoja arvioidaan. TMA-diakuvat tallennetaan korkearesoluutioisina digitaalisina tiedostoina, ja kaksi patologia arvioi jokaisen värjäyksen.