Afvigende splejsninger på grund af mikrosatellit-ustabilitet i tyktarmskræft: Fysiopatologisk og klinisk påvirkning

WP1 - For at identificere exon/intron-forbindelser, der er specifikt påvirket af afvigende splejsningshændelser i MSI CRC. Sekvenser vil først blive evalueret på CNG ved hjælp af Illuminas Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) software. Dette program konverterer intensitetsscore til basisopkald, kvalitetsscore-justeringer og yderligere formater til downstream-analyse og transformerer således hurtigt data til biologisk relevant information. De filtrerede data vil derefter blive overført til CIT-platformen (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, dir: A. de Reynies) skal analyseres af vores bio-informatikekspert. Manchetknappernes arbejdsgang vil blive brugt til at kvantificere transskriptionsekspressionsniveauer i MSI-tumorer. Dette tillader transskriptionssamling, opdagelse og differentielle ekspressionsmålinger ved opløsning på transskriptionsniveau. Fordi standard Cufflinks-arbejdsgangen ikke understøtter genfusionsopdagelse eller kvantificering, vil flere nye funktioner blive indarbejdet i den. For det første vil SoapFuse blive brugt til at detektere fusionsbrudpunkter og til at forudsige fusionsforbindelsessekvenser. Disse vil blive integreret i det humane referencegenom og genannotering fra Gencode-projektet for at give en omfattende, integreret annotering af gentræk til kortlægning af splejsningslæsninger. Integration INCa - PRTK 2014 17/51 processen vil overholde flere regler for at minimere potentialet for at forstyrre kvantificeringen af ​​ekspressionsniveau i kommende analyser. Ved hjælp af vores tilpassede referencegenom og annotation vil TopHat, en aligner, der understøtter splejsningsforbindelse og genfusionskortlægning, blive brugt til RNASeq-kortlægning. Manchetknapper vil derefter blive brugt til at finde nye splejsningsvarianter, herunder nye exon-overspringende isoformer.

Disse vil blive integreret i annotationen ved hjælp af Cuffmerge. Afhængigt af alignment-resultaterne opnået med TopHat, vil adskillige filtre blive anvendt til at fjerne lavkvalitetskandidater til splejsningsvariation og genfusion, såvel som kandidater, der er inkompatible med eksisterende annoterede transkripter. Hvor det er nødvendigt, vil læsninger blive samlet af AbySS og derefter justeret på referencegenomet af BLAT for at give mere information til at forfine annoteringen. Dette vil producere en transkriptomsamling, der indeholder højsikkerhedsgenfusion og exon-overspringsbegivenheder. Identifikation af disse hændelser vil derefter blive udført i individuelle prøver. Cuffdiff vil blive brugt til at analysere kortlægningsresultatet, også baseret på denne transkriptomsamling, til at kalde differentielt udtrykte gener og transkripter og til at detektere differentielle splejsningsændringer. Endelig vil CummeRbund blive brugt til at fortolke og visualisere resultaterne.

Pålideligheden af ​​RNA-seq-analyse vil blive verificeret ved at søge efter afvigende splejsede transkripter, der allerede er rapporteret i MSI-kræftformer (f. MRE11 og HSP110) og for punktmutationer i de kodende sekvenser af målgener for MSI (f.eks. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) og i andre cancerrelaterede gener, der tjener som interne positive kontroller (f.eks. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Det er værd at bemærke, at dette projekt er en del af flere andre udviklet sammen med CIT-Ligue, og som har til formål at karakterisere MSI CRC ved hjælp af Omics-teknologier. Det er vigtigt, at disse data allerede er tilgængelige for et betydeligt antal prøver og kan derfor udnyttes, hvis det kræves.

Data fra RNASeq-kohorten af ​​patienter vil blive grundigt analyseret for at identificere tilbagevendende splejsningsaberrationer (forventes hovedsageligt at være exon-spring), der forekommer specifikt i MSI colontumorer sammenlignet med MSS CRC'er og matchende normal tyktarmsslimhinde. Blandt disse vil undersøgelsen fokusere på splejsning af aberrationer, der skyldes MSI, og som påvirker exoner med en flankerende opstrøms intron indeholdende en ≥ 15 bp LNCR, der er placeret ≤ 6 bp fra intron-exon krydset (splejsningsacceptorsted) (RNASeqMSI- exon præ-liste). Som nævnt ovenfor indeholder ca. 2.000 humane gener mindst én intron med en LNCR meget tæt på AG-splejsningsacceptorstedet ved intron-exon-forbindelsen. Cirka 100 humane gener kunne blive påvirket af tilbagevendende og specifikke afvigende splejsningshændelser på grund af MSI i CRC (for det meste exon-overspringning; udledt fra eksperimenter udført i en begrænset række af CRC-cellelinjer og primære tumorer ved hjælp af exon-arrays; foreløbige og ikke-publicerede resultater).

WP2 - At undersøge for funktionelle forbindelser mellem MSI og afvigende splejsningshændelser.

Efter RNASeq-analysen vil bekræftelse af de afvigende splejsningshændelser på grund af MSI være påkrævet ved hjælp af en anden metodisk tilgang for at eliminere falsk positive hændelser. Dette vil blive opnået med real-time kvantitativ INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR ved brug af interne, specifikke prober (Applied biosystems). For hver sprunget exon i RNASeqMSI-exon præ-listen vil der blive designet et fælles par frem- og omvendte primere placeret i de flankerende exoner.

To interne prober vil blive designet, placeret enten i de overspringede exoner eller spænder over de flankerende exoner ved deres kryds for at påvise henholdsvis normalt eller afvigende splejset mRNA på en kompetitiv måde. Det er meget følsomt og undgår også falske positive signaler på grund af kontaminering med genomisk DNA. Kandidat-exoner, der vil blive bibeholdt, er dem, der viser afvigende og tilbagevendende spring i MSI CRC-cellelinjer og primære tumorer sammenlignet med MSS CRC-kontroller.

I overensstemmelse med vores arbejdshypotese vil undersøgelsen så afgøre, om hver bekræftet splejsningsaberration er MSI-drevet. Dette vil blive opnået som beskrevet tidligere for T17-deletioner i intron 8 af HSP110, der blev identificeret specifikt i MSI CRC og fører til exon 9-spring. Kort fortalt vil allelprofiler af tilstødende intronisk LNCR (se ovenfor) blive analyseret ved hjælp af fluorescensbaseret genotypebestemmelse i panelet af MSI- og MSS CRC-cellelinjer, såvel som i den komplette serie af MSI primære tumorer fra RNASeq-patientkohorten og parret normal. slimhinde (for at vurdere polymorf status). Dette vil blive udført ved hjælp af den samme metode udviklet tidligere i vores laboratorium til analyse af HSP110 T17 DNA-gentagelsen. Efter migrering af PCR-produkter på en ABI 3100 Genetic Analyzer med GS400HD ROX-størrelsesstandarder og POP-7-polymer (Applied Biosystems), vil GeneMapper V4.0-software (Applied Biosystems) blive brugt til at analysere LNCR-spor med anvendelse af en AFLP (Amplified). Fragment Længde Polymorphism) metode. Spor vil blive betragtet som acceptable, når topamplituderne er mellem 100 og 6.000 fluorescensenheder. Et MSI Perl-script er blevet udviklet til automatisk at sammenligne LNCR-spor i normale prøver og tumorprøver, hvilket muliggør påvisning af afvigende LNCR-toppe, der falder uden for den polymorfe zone, der observeres i den normale population. Som med HSP110 forventes det (i) at detektere somatiske deletioner/insertioner i nogle af kandidat-LNCR'erne ved hjælp af denne tilgang, og (ii) at identificere dem, hvis somatiske ændringer på grund af MSI er signifikant forbundet med exon-spring-relaterede hændelser ved RNA-niveau (MSI exon endelig liste).

WP3 - At identificere splejsningshændelser og/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans hos MSI CRC-patienter. Den kliniske relevans af kandidatgener (MSI exon endelige liste) vil blive vurderet ved hjælp af multivariate overlevelsesregressionsmodeller for RFS (Relapse-Free Survival). Antallet af kandidatsplejsningshændelser og/eller LNCR-mutationer er cirka 100 (se WP1 og WP2 ovenfor), og INCa - PRTK 2014 19/51 andre kendte kliniske determinanter såsom stadium, behandling og alder ved diagnose vil blive overvejet i de multivariate modeller. Falske positiver er en af ​​de største faldgruber i at identificere potentielt relevante markører blandt snesevis af kandidater. Da antallet (p) af kovariater, der skal tages i betragtning, vil være af samme størrelsesorden som antallet af individer, vil den "højdimensionelle indstilling" blive nået. Følgelig vil de sædvanlige algoritmer til overlevelsesregressionsmodeller (f. coxph i R) vil undlade at estimere parametrene og identificere hændelser med klinisk relevans. I vores analyse kræver tre hovedmetodiske spørgsmål særlig opmærksomhed, især på det algoritmiske niveau.

WP3 vil blive opdelt i to hovedtrin, hvoraf det første vedrører sammenligninger og udvikling af statistiske algoritmer. Når de er tunet, vil algoritmerne blive kørt for at identificere en eller flere prognostiske biomarkører, der involverer splejsningsbegivenheder og/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans.

Højdimensionelle regressionsmodeller og lassoalgoritmer. I det første trin vil kun splejsningsmutationer og kliniske determinanter i overlevelsesregressionsmodellerne blive overvejet. I dette tilfælde vil variabel udvælgelse og parameterestimering blive udført med en lasso (eller elastisk net) algoritme (se Simon et al. for Cox-modellen og Gaiffas et al. for Aalen-modellen, begge implementeret i R).

I tidligere publikationer blev det påvist, at cut-point-værdier resulterede i maksimale overlevelsesforskelle mellem patientgrupper med store eller små deletioner i HSP110 T17 LNCR og med høj eller lav ekspression af mutant HSP110 mRNA på grund af exon 9-spring ved INCa - PRTK 2014 20/51 mRNA niveau. Da andre splejsningsbegivenheder kunne præsenteres med samme tærskeleffekt, vil cut-points for op til 100 kandidatsplejsningsbegivenheder blive nøje bestemt. Selv i klassisk statistik er cut-pointbestemmelse en kendt vanskelighed på grund af overdetektion. Som for nylig foreslået i en relateret sammenhæng kunne "lassoen med præ-screeningsalgoritme" tilpasses til at inkorporere cut-pointbestemmelsen i hovedalgoritmen.

Andre punkter. Manglende data vil blive håndteret af flere imputationer fra nærmeste nabo eller regressionsmetoder. Undersøgelsen vil overveje mulige interaktioner med brugen af ​​kemoterapi. Som et sidste trin vil estimeringer blive kørt på træningskohorten (Saint-Antoine) for at udlede en prognostisk biomarkør, der vil omfatte splejsningsbegivenheder og/eller LNCR-mutationer med klinisk relevans. Denne biomarkør vil blive valideret på testkohorten (multicenter). Bootstrap-analyse vil blive udført for at fastslå biomarkøren.

WP4 - At igangsætte funktionelle undersøgelser af et begrænset antal klinisk relevante, cancerrelaterede gener, hvis splejsning er stærkt forstyrret i MSI-kræftceller, og at udvikle biologiske værktøjer til at forenkle screening i fremtidige kliniske assays. Som tidligere nævnt er der udført en foreløbig undersøgelse ved hjælp af exon-arrays i en lille serie af MSI CRC-cellelinjer og primære tumorer (upubliceret). Dette blev udført for at evaluere gennemførlighed, tid, omkostninger, negative faktorer, effektstørrelse (statistisk variabilitet) og for at forbedre undersøgelsesdesignet før udførelse af det nuværende forskningsprojekt i fuld skala. Funktionerne af de 100 påviste kandidatgener (hvoraf nogle kan overlappe med dem, der er identificeret fra RNAseq-screening) var ofte relateret til kræftrelaterede processer såsom makromolekylær syntese (30%), celleproliferativ kapacitet eller celledød (20%), lægemiddelresistens (10%) og andre (WNT pathway, metastatisk proces, ændringer i kromosomstruktur). Det nuværende projekt forventer at identificere flere robuste MSI-drevne splejsningsmutanter, der er klinisk relevante (se WP2 og WP3 ovenfor). Disse mutanter kan have enten onkogene eller antionkogene funktioner, givet at nogle (såsom HSP110) kan produceres i høje niveauer, selvom de har negative indvirkninger på tumorcellen (se vores funktionelle hypotese ovenfor vedrørende den forventede skadelige indflydelse af MSI ved LNCR i CRC). I denne sammenhæng vil in vitro funktionelle undersøgelser blive designet til at karakterisere den onkogene virkning af et lille antal (n=5) formodede klinisk relevante mutanter. Disse eksperimenter vil være baseret på forbigående silencing eller overekspression ved hjælp af siRNA eller plasmider og ad hoc biologisk udlæsning i CRC cellulære modeller, der allerede er tilgængelige i vores laboratorium.

Afhængigt af de opnåede resultater kunne yderligere undersøgelser derefter planlægges ved hjælp af stabilt transficerede CRC-modeller xenotransplanteret i nøgne mus. Derudover planlægger undersøgelsen at validere biologiske værktøjer (f.eks. Antistoffer) for at optimere den fremtidige screening af patienter ved hjælp af rutineassays, svarende til vores arbejde med HSP110 og HSP110DE9-mutanten. Tissue Microarrays (TMA'er) vil blive konstrueret af rutinemæssigt forberedte, formalinfikserede og paraffinindlejrede blokke indsamlet INCa - PRTK 2014 21/51 retrospektivt fra patologisk afdeling på Saint-Antoine hospitalet. Neoplastisk væv vil blive udtaget, inklusive den tumorinvasive front (3 til 6 prøver af 0,6 mm diameter vævskerner). Når det er tilgængeligt, vil parrede lymfeknudemetastaser også blive udtaget. Immunhistokemi med antistoffer genereret specifikt (underleverandører) for at genkende vildtype- eller mutantkandidatproteiner vil blive udført på TMA'er. Exon skipping-hændelser er rammeskifte i 2/3 af tilfældene og genererer således trunkerede proteiner, der har immunogene, afvigende C-terminale haler. Korrelationer mellem proteinekspression og klinisk-patologiske træk vil blive evalueret, såvel som deres prognostiske og prædiktive værdier. TMA diasbilleder vil blive optaget som digitale højopløsningsfiler, og evaluering af hver farvning vil blive udført af to patologer.