Nieprawidłowe splicingi spowodowane niestabilnością mikrosatelitarną w raku jelita grubego: wpływ fizjopatologiczny i kliniczny

WP1 — Aby zidentyfikować połączenia ekson/intron, na które w szczególności wpływają nieprawidłowe zdarzenia splicingowe w MSI CRC. Sekwencje zostaną najpierw ocenione w CNG przy użyciu oprogramowania Pipeline CASAVA (Consensus Assessment of Sequence And Variation) firmy Illumina. Ten program konwertuje wyniki intensywności na wywołania podstawowe, wyrównania z punktacją jakości i dodatkowe formaty do dalszej analizy, w ten sposób szybko przekształcając dane w biologicznie istotne informacje. Przefiltrowane dane zostaną następnie przesłane na platformę CIT (Carte d'Identité des Tumeurs; http://cit.ligue-cancer.net, reż: A. de Reynies) do analizy przez naszego bioinformatyka. Przebieg pracy Spinki do mankietów zostanie wykorzystany do ilościowego określenia poziomów ekspresji transkryptu w guzach MSI. Pozwala to na pomiary składania transkryptu, wykrywania i różnicowania ekspresji w rozdzielczości na poziomie transkrypcji. Ponieważ standardowy przepływ pracy Spinki do mankietów nie obsługuje wykrywania ani kwantyfikacji fuzji genów, zostanie do niego włączonych kilka nowych funkcji. Po pierwsze, SoapFuse zostanie wykorzystany do wykrywania punktów przerwania fuzji i przewidywania sekwencji połączeń fuzji. Zostaną one włączone do ludzkiego genomu referencyjnego i adnotacji genów z projektu Gencode, aby zapewnić kompleksową, zintegrowaną adnotację cech genów do mapowania odczytów splicingu. Proces integracji INCa - PRTK 2014 17/51 będzie podlegał kilku zasadom, aby zminimalizować możliwość zakłócenia kwantyfikacji poziomu ekspresji w przyszłych analizach. Z pomocą naszego dostosowanego genomu referencyjnego i adnotacji, TopHat, aligner, który obsługuje połączenia splicingowe i mapowanie fuzji genów, zostanie użyty do mapowania RNASeq. Spinki do mankietów zostaną następnie wykorzystane do znalezienia nowych wariantów składania, w tym nowych izoform z pomijaniem egzonów.

Zostaną one zintegrowane z adnotacją za pomocą Cuffmerge. W zależności od wyników dopasowania uzyskanych za pomocą TopHat, zostanie zastosowanych kilka filtrów w celu usunięcia kandydatów o niskiej jakości do zmienności składania i fuzji genów, a także kandydatów, którzy są niekompatybilni z istniejącymi transkryptami z adnotacjami. W razie potrzeby odczyty zostaną zebrane przez AbySS, a następnie dopasowane do genomu referencyjnego przez BLAT, aby dostarczyć więcej informacji do udoskonalenia adnotacji. Spowoduje to utworzenie zespołu transkryptomu zawierającego fuzję genów o wysokim stopniu pewności i zdarzenia pomijania eksonów. Identyfikacja tych zdarzeń zostanie następnie przeprowadzona w poszczególnych próbkach. Cuffdiff zostanie wykorzystany do analizy wyniku mapowania, również w oparciu o ten zespół transkryptomu, do wywołania różnicowo wyrażanych genów i transkryptów oraz do wykrywania różnicowych zmian splicingu. Wreszcie CummeRbund zostanie wykorzystany do interpretacji i wizualizacji wyników.

Wiarygodność analizy seq RNA zostanie zweryfikowana przez poszukiwanie transkryptów o nieprawidłowym splicingu, które zostały już zgłoszone w nowotworach MSI (np. MRE11 i HSP110) oraz mutacji punktowych w sekwencjach kodujących geny docelowe dla MSI (np. TGFBR2, IGF2R, TCF7L2, AXIN2, PTEN, RIZ) oraz w innych genach związanych z rakiem, które służą jako wewnętrzne kontrole pozytywne (np. KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA). Warto zauważyć, że ten projekt jest częścią kilku innych, opracowanych wspólnie z CIT-Ligue i mających na celu scharakteryzowanie MSI CRC przy użyciu technologii Omics. Co ważne, dane te są już dostępne dla znacznej liczby próbek i dlatego można je wykorzystać w razie potrzeby.

Dane z kohorty pacjentów RNASeq zostaną wszechstronnie przeanalizowane w celu zidentyfikowania powtarzających się aberracji splicingu (oczekuje się, że będą to głównie pomijanie eksonów), które występują szczególnie w guzach okrężnicy MSI w porównaniu z CRC MSS i pasującymi do normalnej błony śluzowej okrężnicy. Wśród nich badanie skupi się na aberracjach splicingowych, które są spowodowane MSI i które wpływają na eksony z flankującym intronem w górę zawierającym LNCR ≥ 15 pz, który jest zlokalizowany ≤ 6 pz od połączenia intron-egzon (miejsce akceptorowe splicingu) (RNASeqMSI- wstępna lista eksonów). Jak stwierdzono powyżej, około 2000 ludzkich genów zawiera co najmniej jeden intron z LNCR bardzo blisko miejsca akceptorowego splicingu AG na połączeniu intron-egzon. Około 100 ludzkich genów może być dotkniętych powtarzającymi się i specyficznymi nieprawidłowymi zdarzeniami splicingu spowodowanymi MSI w CRC (głównie pomijanie eksonów; wywnioskowano z eksperymentów przeprowadzonych na ograniczonej serii linii komórkowych CRC i guzów pierwotnych przy użyciu macierzy eksonów; wyniki wstępne i niepublikowane).

WP2 - Aby zbadać powiązania funkcjonalne między MSI a nieprawidłowymi zdarzeniami splicingu.

Po analizie RNASeq wymagane będzie potwierdzenie nieprawidłowego splicingu spowodowanego MSI przy użyciu innego podejścia metodologicznego w celu wyeliminowania zdarzeń fałszywie dodatnich. Zostanie to osiągnięte za pomocą ilościowego INCa - PRTK 2014 18/51 RT-PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu wewnętrznych, specyficznych sond (Applied Biosystems). Dla każdego pominiętego eksonu na wstępnej liście eksonów RNASeqMSI zostanie zaprojektowana wspólna para starterów do przodu i do tyłu, znajdujących się w eksonach flankujących.

Zostaną zaprojektowane dwie wewnętrzne sondy, umieszczone albo w pominiętych eksonach, albo obejmujące eksony flankujące na ich połączeniu, w celu wykrycia odpowiednio normalnego lub nieprawidłowo splicowanego mRNA w sposób konkurencyjny. Jest bardzo czuły, a także pozwala uniknąć fałszywych pozytywnych sygnałów z powodu zanieczyszczenia genomowym DNA. Egzony kandydujące, które zostaną zachowane, to te, które wykazują nieprawidłowe i nawracające pomijanie w liniach komórkowych MSI CRC i guzach pierwotnych w porównaniu z kontrolami MSS CRC.

Zgodnie z naszą hipotezą roboczą badanie określi następnie, czy każda potwierdzona aberracja splicingu jest napędzana przez MSI. Zostanie to osiągnięte, jak opisano wcześniej dla delecji T17 w intronie 8 HSP110, które zostały zidentyfikowane specyficznie w MSI CRC i prowadzą do pominięcia eksonu 9. W skrócie, profile alleliczne sąsiedniego intronowego LNCR (patrz powyżej) zostaną przeanalizowane przy użyciu genotypowania opartego na fluorescencji w panelu linii komórkowych MSI i MSS CRC, jak również w pełnej serii guzów pierwotnych MSI z kohorty pacjentów RNASeq i sparowanych normalnych błony śluzowej (w celu oceny stanu polimorficznego). Zostanie to przeprowadzone przy użyciu tej samej metody, która została opracowana wcześniej w naszym laboratorium do analizy powtórzeń DNA HSP110 T17. Po migracji produktów PCR na analizatorze genetycznym ABI 3100 ze standardami wielkości GS400HD ROX i polimerem POP-7 (Applied Biosystems), oprogramowanie GeneMapper V4.0 (Applied Biosystems) zostanie użyte do analizy śladów LNCR, z zastosowaniem AFLP (Amplified Biosystems) metoda polimorfizmu długości fragmentów). Ślady zostaną uznane za akceptowalne, gdy amplitudy pików wynoszą od 100 do 6000 jednostek fluorescencji. Skrypt MSI Perl został opracowany do automatycznego porównywania śladów LNCR w próbkach zdrowych i guza, umożliwiając w ten sposób wykrywanie nieprawidłowych pików LNCR, które wykraczają poza strefę polimorficzną obserwowaną w normalnej populacji. Podobnie jak w przypadku HSP110, oczekuje się (i) wykrycia delecji / insercji somatycznych w niektórych kandydujących LNCR przy użyciu tego podejścia oraz (ii) identyfikacji tych, których zmiany somatyczne spowodowane MSI są istotnie związane ze zdarzeniami związanymi z pomijaniem egzonu w Poziom RNA (ostateczna lista eksonów MSI).

WP3 – Aby zidentyfikować zdarzenia splicingowe i/lub mutacje LNCR o znaczeniu klinicznym u pacjentów z MSI CRC. Znaczenie kliniczne genów kandydujących (ostateczna lista eksonów MSI) zostanie ocenione przy użyciu wielowymiarowych modeli regresji przeżycia dla RFS (przeżycie bez nawrotów). Liczba potencjalnych zdarzeń splicingowych i/lub mutacji LNCR wynosi około 100 (patrz WP1 i WP2 powyżej), a inne znane determinanty kliniczne, takie jak etap, leczenie i wiek w momencie rozpoznania, zostaną uwzględnione w modelach wielowymiarowych. Fałszywe alarmy to jedna z głównych pułapek w identyfikowaniu potencjalnie istotnych markerów wśród dziesiątek kandydatów. Ponieważ liczba (p) współzmiennych, które należy wziąć pod uwagę, będzie tego samego rzędu, co liczba osobników, zostanie osiągnięte „ustawienie wysokowymiarowe”. W związku z tym zwykłe algorytmy modeli regresji przeżycia (np. coxph w R) nie pozwoli oszacować parametrów i zidentyfikować zdarzeń o znaczeniu klinicznym. W naszej analizie szczególnej uwagi wymagają trzy główne kwestie metodologiczne, szczególnie na poziomie algorytmicznym.

WP3 zostanie podzielony na dwa główne etapy, z których pierwszy dotyczy porównań i rozwoju algorytmów statystycznych. Po dostrojeniu algorytmy zostaną uruchomione w celu zidentyfikowania biomarkerów prognostycznych, które obejmują zdarzenia splicingu i/lub mutacje LNCR o znaczeniu klinicznym.

Wielowymiarowe modele regresji i algorytmy lassa. W pierwszym kroku uwzględnione zostaną tylko mutacje splicingowe i determinanty kliniczne w modelach regresji przeżycia. W takim przypadku selekcja zmiennych i estymacja parametrów zostanie przeprowadzona za pomocą algorytmu lasso (lub elastycznej sieci) (zob. Simon i in. dla modelu Coxa oraz Gaiffas i in. dla modelu Aalen, oba zaimplementowane w R).

We wcześniejszych publikacjach wykazano, że wartości punktu odcięcia skutkowały maksymalnymi różnicami przeżycia między grupami pacjentów z dużymi lub małymi delecjami w HSP110 T17 LNCR oraz z wysoką lub niską ekspresją zmutowanego mRNA HSP110 z powodu pominięcia eksonu 9 w INCa - PRTK 2014 20/51 poziom mRNA. Ponieważ inne zdarzenia splicingu mogą mieć ten sam efekt progowy, punkty odcięcia dla maksymalnie 100 potencjalnych zdarzeń splicingu zostaną dokładnie określone. Nawet w klasycznej statystyce określenie punktu odcięcia jest znaną trudnością z powodu nadmiernej detekcji. Jak niedawno zaproponowano w pokrewnym kontekście, „lasso z algorytmem wstępnego przesiewania” można dostosować, aby włączyć wyznaczanie punktu odcięcia do głównego algorytmu.

Inne punkty. Brakujące dane będą obsługiwane przez wielokrotne imputacje z metod najbliższego sąsiada lub regresji. W badaniu rozważone zostaną możliwe interakcje ze stosowaniem chemioterapii. Na ostatnim etapie zostaną przeprowadzone oszacowania kohorty szkoleniowej (Saint-Antoine) w celu uzyskania prognostycznego biomarkera, który będzie obejmował zdarzenia splicingu i/lub mutacje LNCR o znaczeniu klinicznym. Ten biomarker zostanie zweryfikowany na kohorcie testowej (wieloośrodkowej). Zostanie przeprowadzona analiza Bootstrap w celu ustalenia biomarkera.

WP4 – Zainicjowanie badań funkcjonalnych na ograniczonej liczbie istotnych klinicznie genów związanych z rakiem, których splicing jest silnie zaburzony w komórkach nowotworowych MSI, oraz opracowanie narzędzi biologicznych w celu uproszczenia badań przesiewowych w przyszłych testach klinicznych. Jak wspomniano wcześniej, przeprowadzono wstępne badanie przy użyciu macierzy eksonów w małej serii linii komórkowych MSI CRC i guzów pierwotnych (nieopublikowane). Zostało to przeprowadzone w celu oceny wykonalności, czasu, kosztów, niekorzystnych czynników, wielkości efektu (zmienności statystycznej) oraz ulepszenia projektu badania przed wykonaniem obecnego projektu badawczego na pełną skalę. Funkcje 100 wykrytych genów kandydujących (niektóre z nich mogą pokrywać się z tymi zidentyfikowanymi podczas badań przesiewowych RNAseq) były często związane z procesami nowotworowymi, takimi jak synteza makrocząsteczkowa (30%), zdolność do proliferacji komórek lub śmierć komórki (20%), lekooporność (10%) i inne (ścieżka WNT, proces przerzutowy, zmiany w strukturze chromosomów). Obecny projekt ma na celu zidentyfikowanie kilku solidnych mutantów splicingowych kierowanych przez MSI, które są istotne klinicznie (patrz WP2 i WP3 powyżej). Mutanty te mogą pełnić funkcje onkogenne lub antionogenne, biorąc pod uwagę, że niektóre (takie jak HSP110) mogą być wytwarzane na wysokich poziomach, nawet jeśli mają negatywny wpływ na komórkę nowotworową (patrz nasza hipoteza funkcjonalna powyżej dotycząca oczekiwanego szkodliwego wpływu MSI na LNCR w CRK). W tym kontekście badania funkcjonalne in vitro zostaną zaprojektowane w celu scharakteryzowania wpływu onkogennego niewielkiej liczby (n=5) przypuszczalnych klinicznie istotnych mutantów. Eksperymenty te będą oparte na przejściowym wyciszaniu lub nadekspresji przy użyciu siRNA lub plazmidów oraz biologicznym odczycie ad hoc w dostępnych już w naszym laboratorium modelach komórkowych CRC.

W zależności od uzyskanych wyników można zaplanować dalsze badania z wykorzystaniem stabilnie transfekowanych modeli CRC przeszczepionych ksenoprzeszczepem nagim myszom. Ponadto plan badań ma na celu walidację narzędzi biologicznych (m.in. przeciwciała) w celu optymalizacji przyszłych badań przesiewowych pacjentów przy użyciu rutynowych testów, podobnie jak w naszej pracy z HSP110 i mutantem HSP110DE9. Mikromacierze tkankowe (TMA) zostaną skonstruowane z rutynowo przygotowanych, utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie bloczków pobranych retrospektywnie z Oddziału Patologii Szpitala Saint-Antoine. Zostanie pobrana próbka tkanki nowotworowej, w tym frontu inwazyjnego guza (od 3 do 6 próbek rdzeni tkankowych o średnicy 0,6 mm). Jeśli to możliwe, zostaną również pobrane próbki przerzutów z parzystych węzłów chłonnych. Na TMA zostanie przeprowadzona immunohistochemia z przeciwciałami wytworzonymi specyficznie (podwykonawstwo) w celu rozpoznania kandydujących białek typu dzikiego lub zmutowanych. Zdarzenia pomijania eksonu polegają na przesunięciu ramki odczytu w 2/3 przypadków, a tym samym generują skrócone białka, które mają immunogenne, nieprawidłowe C-końcowe ogony. Ocenione zostaną korelacje między ekspresją białek a cechami kliniczno-patologicznymi oraz ich wartości prognostyczne i predykcyjne. Obrazy preparatów TMA zostaną przechwycone jako pliki cyfrowe o wysokiej rozdzielczości, a ocena każdego barwienia zostanie przeprowadzona przez dwóch patologów.