Влияние костной ткани на гемостаз

Тромбинография представляет собой функциональное исследование гемостаза, позволяющее охарактеризовать кинетику и количество тромбина. Его принцип основан на регистрации активности тромбина in vitro с помощью флуорометрии. Образовавшийся тромбин ведет сигнал путем активации флуорогенных субстратов. Интенсивность полученного сигнала коррелирует с образованием тромбина посредством сравнительного измерения флуоресценции известного стандартного образца тромбиновой активности. Анализ осуществляется специальным программным обеспечением: Thrombinoscope®. Используемая реакционная среда представляет собой бедную плазму тромбоцитами (PPP).

Программное обеспечение определяет количество образовавшегося тромбина (нМ) в зависимости от времени (в минутах) и вычисляет значения:

• Лаг-тайм: латентный период до начала синтеза тромбина.
• Start Tail: продолжительность процесса.
• Пик: пик тромбина, максимальная скорость образования тромбина.
• ЭТП (потенциал эндогенного тромбина): площадь под кривой, представляющая общий потенциал образования тромбина.
• Время до пика: время, необходимое для достижения пика тромбина. Именно эти значения и будут служить критериями оценки для нашего исследования.

Костный тип

Губчатая кость составляет большинство в коротких костях и эпифизах длинных костей. Он четкий, состоит из мелких костных пятен, расположенных неконцентрически вокруг широких открытых полостей, заполненных костным мозгом, богатым клетками и богато васкуляризированными. Губчатая кость окружена компактной костью. На уровне лунок зубов этот костный тип встречается, в частности, на уровне межкорневых перегородок.

Компактная кость образует кортикальный слой. Он плотный, состоит из систем Гаверса. Каждая система образована редуцированным центральным каналом, содержащим некоторое количество васкуляризированной соединительной ткани, и толстыми концентрическими костными полосками, внутри и между которыми подготавливаются остеоциты. Этот костный тип расположен на альвеолярном уровне в наружной части.

Ингибиторы

Чтобы проверить возможные пути образования тромбина, исследователи должны использовать специфические ингибиторы этих вероятных путей активации:

• Ингибитор внешнего пути свертывания: антитело к тканевому фактору.
• Ингибитор внутреннего пути свертывания: бычий апротинин.
• Ингибитор фосфолипидов: аннексин В. Методика исследования

План расследования

• Информация о пациентах, имеющих право на участие в исследовании (пациенты, нуждающиеся в удалении зубов с удалением кости), относительно методов и целей исследования посредством информационной записки.
• При согласии пациента на участие в исследовании, проведение костных взятий и подготовка костных взятий для замораживания в жидком азоте.
• Костный забор связывают с некоторым количеством плазмы (из пулов плазмы, используемых в лаборатории для калибровки различных автоматов) и измеряют образование тромбина с помощью тромбинографии.

Для этого костные фрагменты помещают на дно лунок микропланшета, затем добавляют 10 мкл буфера HBS. Фрагментация костных заготовок будет осуществляться с помощью стерильного материала и ограничения времени манипуляции за исключением окружающей среды.

Каждый образец будет обрабатываться там трижды. Две лунки будут предназначены для стандартного тромбина (20 мкл). Будут использованы два контроля: - положительный контроль: 10 мкл тканевого фактора в концентрации 1 или 5 пМ и 10 мкл PPL в разведении 1/100.

- Отрицательный контроль: будет использовано 20 мкл физиологического раствора соли. В каждую из лунок закладывают по 80 микролитров плазмы. Пятьдесят микролитров флуоресцентного субстрата будут добавлены в заранее приготовленный буфер смеси - субстрат флуорогенный, и устройство распределит по 20 мкл смеси в каждую из лунок, таким образом, в итоге содержа 120 мкл.

Измерения проводились каждые 20 секунд в течение 60 минут с помощью Fluoroskan Ascent Reader. Программное обеспечение Thrombinoscope® (версия 3.0.0.29, Maastricht) преобразует интенсивность флуоресценции нМ тромбина в зависимости от времени.

Результаты измерений будут сгруппированы по губчатой ​​кости, компактной кости, контрольному FT1pM, контрольному FT5pM и вторично усреднены.

По полученным результатам образцы (компактные и/или губчатые), положительные на генез тромбина, будут проанализированы на наличие специфических ингибиторов различных возможных путей активации свертывания крови. Калибровки будут сделаны для выбора наиболее подходящей концентрации ингибиторов.

Логистика исследования

Информация о целях и методах исследования будет предоставлена ​​каждому пациенту, получившему пользу от одного или нескольких удалений зубов с удалением кости. При согласии пациента на участие в исследовании (устное соглашение) забор костной ткани, автоматически связанный с удалением зуба, сохраняется.

После взятия костные фрагменты погружают в заранее приготовленный раствор криоконсервации, затем помещают в морозильную камеру при температуре -70°С минимум на 24 часа перед погружением в жидкий азот.

Меры тромбинографии будут осуществляться из расчета анализа каждые две недели, с регулируемой периодичностью в зависимости от количества наборов, сделанных в течение периода.