Wpływ tkanki kostnej na hemostazę

Trombinografia jest czynnościową eksploracją hemostazy pozwalającą na scharakteryzowanie kinetyki i ilości trombiny. Jego zasada opiera się na rejestrowaniu aktywności trombiny in vitro metodą fluorometryczną. Utworzona trombina przewodzi sygnał poprzez aktywację substratów fluorogennych. Intensywność odbieranego sygnału jest skorelowana z wytwarzaniem trombiny przez porównawczy pomiar fluorescencji znanej próbki wzorcowej o aktywności trombiny. Analiza jest realizowana przez specjalne oprogramowanie: Thrombinoscope®. Stosowanym środowiskiem reakcyjnym jest słabe osocze w płytkach krwi (PPP).

Oprogramowanie określa ilość wytworzonej trombiny (nM) w zależności od czasu (w minutach) i oblicza wartości:

• Czas opóźnienia: okres utajony przed rozpoczęciem syntezy trombiny.
• Start Tail: czas trwania procesu.
• Szczyt: szczyt trombiny, to maksymalna szybkość generowanej trombiny.
• ETP (potencjał endogennej trombiny): pole pod krzywą reprezentujące całkowity potencjał wytwarzania trombiny.
• Czas do szczytu: czas wymagany do osiągnięcia szczytu trombiny. To właśnie te wartości posłużą jako kryteria oceny naszego badania.

Typ kostny

Kość gąbczasta występuje głównie w kościach krótkich i nasadach kości długich. Jest krucha, składa się z drobnych łat kostnych ułożonych nie koncentrycznie wokół szeroko otwartych jam, wypełnionych bogatym w komórki szpikiem kostnym i bogato unaczynionym. Kość gąbczasta otoczona jest kością zbitą. Na poziomie zębodołów ten typ kostny występuje w szczególności na poziomie przegród międzykorzeniowych.

Zwarta kość tworzy warstwę korową. Jest gęsty, składa się z systemów Haverów. Każdy system jest utworzony przez zredukowany kanał centralny zawierający unaczynioną tkankę łączną i grube, koncentryczne małe paski kostne, w których i pomiędzy którymi przygotowuje się osteocyty. Ten typ kostny znajduje się na poziomie zębodołu w części zewnętrznej.

Inhibitory

Aby zweryfikować możliwe sposoby związane z tworzeniem trombiny, badacze użyją specyficznych inhibitorów tych prawdopodobnych sposobów aktywacji:

• Inhibitor zewnętrznego sposobu krzepnięcia: przeciwciało przeciw czynnikowi tkankowemu.
• Inhibitor wewnętrznego procesu krzepnięcia: bydlęca aprotynina.
• Inhibitor fosfolipidów: aneksyna V. Metodyka badań

Plan śledztwa

• Informacja o pacjentach zakwalifikowanych do badania (pacjentów wymagających ekstrakcji zęba z usunięciem kości) o metodach i celach badania za pomocą karty informacyjnej.
• Jeśli pacjent wyrazi zgodę na udział w badaniu, wykonanie pobrań kostnych i przygotowanie pobrań kostnych do zamrożenia w ciekłym azocie.
• Połączone przez pobieranie kostne z pewnym osoczem (z puli osocza używanego w laboratorium do kalibracji różnych automatów) i pomiarem genezy trombiny za pomocą trombinografii.

Aby to zrobić, fragmenty kostne zostaną umieszczone na dnie dołków mikropłytki, a następnie dodane zostanie 10 µl buforu HBS. Fragmentacja pobranych kości będzie realizowana za pomocą sterylnego materiału i przy ograniczeniu czasu manipulacji poza otoczeniem.

Każda próbka będzie tam przetwarzana w trzech egzemplarzach. Dwa dołki będą przeznaczone na standardową trombinę (20 µl). Stosowane będą dwie kontrole: - kontrola pozytywna: 10µl czynnika tkankowego w stężeniu 1 lub 5 pM oraz 10µl PPL w rozcieńczeniu 1/100.

- Kontrola negatywna: zostanie użyte 20 µl roztworu soli fizjologicznej. Osiemdziesiąt mikrolitrów osocza zostanie umieszczone w każdym ze studzienek. Pięćdziesiąt mikrolitrów substratu fluorescencyjnego zostanie dodanych do przygotowanej wcześniej mieszaniny bufor - substrat fluorogeniczny, a urządzenie rozprowadzi po 20 µL mieszaniny w każdym z dołków, tak aby na końcu znalazło się 120 µL.

Pomiary były wykonywane co 20 sekund przez 60 minut przez Fluoroskan Ascent Reader. Oprogramowanie Trombinoskopu® (wersja 3.0.0.29, Maastricht) przekształca intensywność fluorescencji nM trombiny w zależności od czasu.

Wyniki pomiarów zostaną pogrupowane według kości gąbczastej, kości zbitej, kontrolnej FT1pM, kontrolnej FT5pM i uśrednione wtórnie.

Zgodnie z uzyskanymi wynikami, próbki (zwarte i/lub gąbczaste) dodatnie pod względem genezy trombiny będą analizowane w obecności specyficznych inhibitorów różnych możliwych sposobów aktywacji krzepnięcia. Wykonane zostaną kalibracje w celu wybrania najbardziej odpowiedniego stężenia inhibitorów.

Logistyka badania

Każdy pacjent korzystający z jednej lub kilku ekstrakcji zęba z usunięciem kości zostanie poinformowany o celach i sposobie badania. Jeżeli pacjent wyrazi zgodę na udział w badaniu (umowa ustna), pobranie kości, związane automatycznie z ekstrakcją zęba, zostanie zachowane.

Po pobraniu fragmenty kostne zostaną zanurzone w przygotowanym wcześniej roztworze kriokonserwacji, a następnie umieszczone w zamrażarce w temperaturze -70°C na minimum 24 godziny przed zanurzeniem w ciekłym azocie.

Pomiary trombinografii będą wykonywane z częstotliwością analizy co drugi tydzień, z dostosowaną częstotliwością w zależności od liczby rekrutacji przeprowadzonych w danym okresie.