Transformationspotential för E2-exponerade bröstcancermottaglighet Genmutation Heterozygota epiteliala bröstceller

För att studera de olika celllinjerna planerar vi att isolera och föröka luminala progenitorer från en normal mänsklig bröstvävnad. För detta ändamål kommer 10 humana bröstvävnadsprover att tas från riskreducerande mastektomi hos friska premenopausala kvinnor med BRCA1-mutationer. Vävnader från 10 premenopausala kvinnor som genomgår estetisk bröstoperation utan familjehistoria av bröst- eller äggstockscancer kommer att fungera som kontrollgrupp. För att isolera primära epitelceller kommer human bröstvävnad att malas och enzymatiskt smältas över natten i kollagenas och hyaluronidas för att ge suspension av epitelorganoider. Dessa organoider kommer att samlas upp och spjälkas ytterligare med trypsin, dispas och deoxiribonukleas 1 (DNAse), kommer att filtreras för att generera en enda cellsuspension, resuspenderas i Hanks + 2 % fetalt bovint serum (FBS) och 0,1 mg/ml DNAs, och även inkuberades med en blockerande antikropp i 15 minuter på is.

Celler kommer att behandlas med östrogen (E2) (10 nM) i 48 timmar och kommer sedan att bestrålas för att inducera dubbelsträngsbrott. Celler kommer att bestrålas med 8 Gray (Gy) med en Co60-källa.

För att genomföra vår studie kommer östrogenexponerade och oexponerade BRCA-mutations heterozygota epitelial bröstceller att bestrålas och 1 timme senare kommer RNA att extraheras från cellerna med hjälp av Tri-reagens (Sigma). RNA:t kommer att omvandlas till ett bibliotek av cDNA-fragment (komplementärt DNA) och kommer att skickas för djupsekvensering i illumina Hi-Seq-plattformen.