Potencial de transformação de células mamárias epiteliais heterozigóticas expostas ao câncer de mama E2

Para estudar as diferentes linhagens celulares, planejamos isolar e propagar progenitores luminais de um tecido mamário humano normal. Para tanto, 10 amostras de tecido mamário humano serão obtidas de mastectomia redutora de risco em mulheres saudáveis ​​na pré-menopausa com mutações em BRCA1. Tecidos de 10 mulheres na pré-menopausa submetidas a cirurgia estética de mama sem histórico familiar de câncer de mama ou ovário servirão como grupo controle. A fim de isolar células epiteliais primárias, o tecido mamário humano será picado e digerido enzimaticamente durante a noite em colagenase e hialuronidase para produzir suspensão de organoides epiteliais. Esses organoides serão coletados e posteriormente digeridos com tripsina, dispase e desoxirribonuclease 1 (DNAse), serão filtrados para gerar uma única suspensão celular, ressuspensa em Hank's + 2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1 mg/mL de DNAse, e também incubado com anticorpo bloqueador por 15 minutos em gelo.

As células serão tratadas com estrogênio (E2) (10 nM) por 48 h e então serão irradiadas para indução da quebra da dupla fita. As células serão irradiadas com 8 Gray (Gy) usando uma fonte de Co60.

Para realizar nosso estudo, células mamárias heterozigóticas com mutação BRCA expostas e não expostas ao estrogênio serão irradiadas e 1 h depois o RNA será extraído das células usando Tri-reagente (Sigma). O RNA será convertido em uma biblioteca de fragmentos de cDNA (DNA complementar) e será enviado para sequenciamento profundo na plataforma illumina Hi-Seq.