Transformationspotential von E2-exponierten Brustkrebsanfälligkeits-Genmutationen heterozygoter epithelialer Brustzellen

Um die verschiedenen Zelllinien zu untersuchen, planen wir, luminale Vorläufer aus einem normalen menschlichen Brustgewebe zu isolieren und zu vermehren. Dazu werden 10 humane Brustgewebeproben aus risikomindernder Mastektomie bei gesunden prämenopausalen Frauen mit BRCA1-Mutationen gewonnen. Gewebe von 10 prämenopausalen Frauen, die sich einer ästhetischen Brustoperation ohne familiäre Vorgeschichte von Brust- oder Eierstockkrebs unterziehen, dienen als Kontrollgruppe. Um primäre Epithelzellen zu isolieren, wird menschliches Brustgewebe zerkleinert und über Nacht in Kollagenase und Hyaluronidase enzymatisch verdaut, um eine Suspension von epithelialen Organoiden zu erhalten. Diese Organoide werden gesammelt und weiter mit Trypsin, Dispase und Desoxyribonuklease 1 (DNAse) verdaut, werden filtriert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, in Hank's + 2 % fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mg/ml DNAse resuspendiert, und auch mit einem blockierenden Antikörper für 15 Minuten auf Eis inkubiert.

Die Zellen werden 48 h lang mit Östrogen (E2) (10 nM) behandelt und dann zur Induktion des Doppelstrangbruchs bestrahlt. Die Zellen werden mit 8 Gray (Gy) unter Verwendung einer Co60-Quelle bestrahlt.

Um unsere Studie durchzuführen, werden Östrogen-exponierte und nicht-exponierte BRCA-Mutations-heterozygote epitheliale Brustzellen bestrahlt und 1 h später wird RNA aus den Zellen unter Verwendung von Tri-Reagenz (Sigma) extrahiert. Die RNA wird in eine Bibliothek von cDNA-Fragmenten (komplementäre DNA) umgewandelt und zur Tiefensequenzierung in die Illumina Hi-Seq-Plattform gesendet.