E2暴露乳腺癌易感基因突变杂合上皮乳腺细胞的转化潜能

为了研究不同的细胞谱系，我们计划从正常人乳腺组织中分离和繁殖管腔祖细胞。 为此，将从具有 BRCA1 突变的健康绝经前妇女的降低风险的乳房切除术中获得 10 个人类乳腺组织样本。 来自 10 名接受美容乳房手术且没有乳腺癌或卵巢癌家族史的绝经前妇女的组织将作为对照组。 为了分离原发性上皮细胞，人类乳腺组织将在胶原酶和透明质酸酶中被切碎和酶消化过夜，以产生上皮类器官的悬浮液。 这些类器官将被收集并用胰蛋白酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶 1 (DNAse) 进一步消化，将被过滤以产生单细胞悬浮液，再悬浮于 Hank's + 2% 胎牛血清 (FBS) 和 0.1 mg/mL DNAse 中，并且与封闭抗体在冰上孵育 15 分钟。

细胞将用雌激素 (E2) (10 nM) 处理 48 小时，然后进行辐照以诱导双链断裂。 将使用 Co60 源用 8 戈瑞 (Gy) 照射细胞。

为了完成我们的研究，雌激素暴露和未暴露的 BRCA 突变杂合上皮乳腺细胞将被照射，1 小时后使用三试剂 (Sigma) 从细胞中提取 RNA。 RNA 将被转化为 cDNA（互补 DNA）片段文库，并将被发送到 illumina Hi-Seq 平台进行深度测序。