Diagnostiska biomarkörer relaterade till periodontal sjukdomsaktivitet hos diabetiker

Denna longitudinella fallkontrollstudie genomfördes vid University of São Paulo mellan mars 2009 och juni 2012 som ett gemensamt samarbete mellan avdelningen för oral kirurgi och parodontologi och avdelningen för internmedicin, avdelningen för endokrinologi och metabolism. Den granskades och godkändes av Institutional Human Ethics Research Committee vid Ribeirão School of Dentistry - University of Sao Paulo (process nr. 2009.1.88.58.7).

Den kliniska fästförlusten över 1 mm bestämdes enligt toleransmetoden anpassad till den datoriserade parodontala sonden, med hänsyn tagen till standardavvikelsen på 0,3 mm för den elektroniska sonden multiplicerat med 3. Tänder med proteser eller furkationsskador beaktades inte. De parodontala ställena som hade denna kliniska bindning kallades aktiva ställen.

Innan den första kliniska undersökningen påbörjades gjordes en supragingival skalning med ultraljudsapparat för att underlätta undersökningen. De kliniska parametrarna som utvärderades var: sonderingsfickans djup, relativ klinisk vidhäftningsnivå och blödning vid sondering registrerades på sex ställen per tand med hjälp av en datoriserad periodontal sond. För att minska variationerna mellan baslinje- och 12-månadersutvärderingar användes en akrylstent för att standardisera positionen för den datoriserade parodontala sonden. Blödning vid sondering bedömdes efter närvaro eller frånvaro av blödning upp till 20 sekunder efter sondering. Plackindex, närvaro eller frånvaro av biofilm, registrerades på fyra ställen per tand. Det verifierades också att furkationen var inblandad med hjälp av en manuell periodontal sond.

Alla kliniska parametrar registrerades två veckor efter supragingival skalning (baslinje) och två månader efter icke-kirurgisk periodontal terapi av enblindad kalibrerad undersökare. En kalibreringsövning utfördes för att uppnå acceptabel intraexaminatorreproducerbarhet.

För den metabola kontrollbedömningen analyserades HbA1c-nivåerna hos patienter från båda grupperna vid baslinjen och två månader efter icke-kirurgisk periodontal terapi, vid endokrinologisk klinik vid Ribeirão Preto School of Medicine, University of São Paulo. Alla diabetiker var under överinseende av en endokrinolog som fick rådet att meddela varje förändring i medicinintag eller kost.

Ett program för plackkontroll med tandprofylax och oral hygieninstruktion, och skalnings- och rotplaneringssessionerna utfördes av samma operatör med hjälp av kyretter och en ultraljudsapparat i PD- och PD+DM-grupper. Alla skalnings- och rotplaneringsprocedurer inspekterades för en andra operatör. Munhygienen sågs över efter en vecka och efter en månads periodontal desinfektion, följt av tandprofylax.

I PD+DM-gruppen var den icke-kirurgiska parodontala behandlingen associerad med systemisk doxycyklin 100 mg/dag, under två veckor efter en initial dos på 200 mg, påbörjad dagen före parodontalbehandling. Patienter i PD-gruppen hade ingen tillgång till information om administrering av antibiotika till patienter i PD+DM-gruppen.

Icke-stimulerad hel upphostad saliv samlades upp (~ 3 ml) från varje individ i sterila rör. Försökspersonerna avstod från att äta, dricka och munhygien i 2 timmar före salivuppsamling. Salivprover placerades omedelbart på is och alikvoterades före frysning vid -80º Celsius. Prover tinades och analyserades inom 6 månader efter insamling.

En komplett serie röntgenbilder togs av varje patient vid baslinjen, med användning av parallelliseringstekniken. Två månader efter parodontalbehandling togs röntgenbilder med samma teknik på tänder med aktiva parodontala ställen. Därefter digitaliserades röntgenbilderna i taggat bildfilformat (TIFF) på en skanner. Digitala subtraktionsröntgenbilder utfördes med baslinje- och 2-månadersröntgenbilder med användning av specifik programvara. Endast tänder med interproximala platser med periodontal sjukdomsaktivitet inkluderades i denna analys. Förändringar mellan röntgenbilder avbildades som ett mörkt område för förlust av alveolär benmassa. Dessa områden mättes (mm2) med hjälp av specifik mätmjukvara. Liksom i den kliniska undersökningen utfördes det intra-granskarkalibrering för mätningar av områden med radiografisk densitetsförlust.

Gingivalvävnadsprover erhölls från aktiva ställen hos varje patient i båda grupperna under regelbunden parodontitkirurgi. Den utskurna tandköttskragen avlägsnades sedan försiktigt från rötterna och den alveolära processen. Gingivalbiopsi omfattade epitel- och bindväv. Proverna sänks omedelbart ned i flytande kväve för att sedan lagras vid -80º Celsius för RNA-extraktion och genuttrycksanalys.

Totalt RNA från biopsier extraherades med hjälp av Trizol-reagenset enligt anvisningarna från tillverkaren. Från 1 µg totalt RNA syntetiserades en sträng av komplementärt DNA (cDNA) genom en omvänd transkriptionsreaktion enligt anvisningarna från tillverkaren. Vid slutet av denna reaktion lagrades cDNA vid -20° Celsius för senare användning. Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Array möjliggjorde samtidig analys av 84 gener involverade i specifika signalvägar. Generna som ingår i PCR-arrayplattor för humana inflammatoriska cytokiner och receptorer.