Diagnostische Biomarker im Zusammenhang mit der Parodontalerkrankungsaktivität bei Diabetikern

Diese Fall-Kontroll-Längsschnittstudie wurde zwischen März 2009 und Juni 2012 an der Universität von São Paulo in Zusammenarbeit der Abteilung für Oralchirurgie und Parodontologie und der Abteilung für Innere Medizin, Abteilung für Endokrinologie und Stoffwechsel, durchgeführt. Es wurde vom Institutional Human Ethics Research Committee der Ribeirão School of Dentistry – Universität von Sao Paulo überprüft und genehmigt (Prozess-Nr. 2009.1.88.58.7).

Der klinische Attachmentverlust über 1 mm wurde gemäß der an die computergestützte parodontale Sonde angepassten Toleranzmethode unter Berücksichtigung der Standardabweichung von 0,3 mm für die elektronische Sonde multipliziert mit 3 bestimmt. Zähne mit Prothesen oder Furkationsläsionen wurden nicht berücksichtigt. Die parodontalen Stellen, die diese klinische Bindung aufwiesen, wurden als aktive Stellen bezeichnet.

Vor Beginn der ersten klinischen Untersuchung wurde zur Erleichterung der Untersuchung eine supragingivale Zahnsteinentfernung mit einem Ultraschallgerät durchgeführt. Die ausgewerteten klinischen Parameter waren: Tiefe der Sondierungstasche, relatives klinisches Befestigungsniveau und Blutung bei der Sondierung wurden mit Hilfe einer computergestützten parodontalen Sonde an sechs Stellen pro Zahn aufgezeichnet. Um die Abweichungen zwischen den Ausgangswerten und den 12-Monats-Bewertungen zu verringern, wurde ein Acrylstent verwendet, um die Position der computergestützten Parodontalsonde zu standardisieren. Die Blutung bei der Sondierung wurde anhand des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer Blutung bis zu 20 Sekunden nach der Sondierung beurteilt. Der Plaque-Index, also das Vorhandensein oder Fehlen von Biofilm, wurde an vier Stellen pro Zahn aufgezeichnet. Die Furkationsbeteiligung wurde auch mit Hilfe einer manuellen Parodontalsonde überprüft.

Alle klinischen Parameter wurden zwei Wochen nach der supragingivalen Zahnsteinentfernung (Ausgangswert) und zwei Monate nach der nicht-chirurgischen Parodontaltherapie durch einen einfach verblindeten, kalibrierten Untersucher erfasst. Eine Kalibrierungsübung wurde durchgeführt, um eine akzeptable Reproduzierbarkeit innerhalb des Prüfers zu erreichen.

Zur Beurteilung der Stoffwechselkontrolle wurden die HbA1c-Werte bei Patienten beider Gruppen zu Studienbeginn und zwei Monate nach der nicht-chirurgischen Parodontaltherapie in der Klinik für Endokrinologie der Ribeirão Preto School of Medicine der Universität São Paulo analysiert. Alle Diabetiker standen unter der Aufsicht eines Endokrinologen, der angewiesen wurde, jede Änderung der Medikamenteneinnahme oder Ernährung mitzuteilen.

Ein Programm zur Plaquekontrolle mit Zahnprophylaxe und Anleitung zur Mundhygiene sowie die Zahnsteinentfernungs- und Wurzelplanungssitzungen wurden von demselben Bediener unter Verwendung von Küretten und einem Ultraschallgerät in PD- und PD+DM-Gruppen durchgeführt. Alle Skalierungs- und Wurzelplanungsverfahren wurden für einen zweiten Bediener überprüft. Die Mundhygiene wurde nach einer Woche und nach einem Monat parodontaler Desinfektion überprüft, gefolgt von einer Zahnprophylaxe.

In der PD+DM-Gruppe war die nicht-chirurgische Parodontaltherapie mit systemischem Doxycyclin 100 mg/Tag für zwei Wochen nach einer Anfangsdosis von 200 mg verbunden, die am Tag vor der Parodontaltherapie begonnen wurde. Patienten der PD-Gruppe hatten keinen Zugang zu Informationen über die Verabreichung von Antibiotika an Patienten der PD+DM-Gruppe.

Von jedem Probanden wurde nicht stimulierter, vollständiger Speichel (ca. 3 ml) in sterilen Röhrchen gesammelt. Vor der Speichelsammlung wurde den Probanden 2 Stunden lang auf Essen, Trinken und Mundhygiene verzichtet. Speichelproben wurden sofort auf Eis gelegt und vor dem Einfrieren bei -80 °C aliquotiert. Die Proben wurden innerhalb von 6 Monaten nach der Entnahme aufgetaut und analysiert.

Zu Studienbeginn wurde bei jedem Patienten eine vollständige Serie von Röntgenaufnahmen unter Verwendung der Paralleltechnik angefertigt. Zwei Monate nach der Parodontaltherapie wurden mit der gleichen Technik Röntgenaufnahmen von Zähnen mit aktivem Parodontalbereich angefertigt. Anschließend wurden die Röntgenbilder auf einem Scanner im Tagged Image File Format (TIFF) digitalisiert. Mithilfe spezieller Software wurden digitale Subtraktionsröntgenaufnahmen mit den Ausgangs- und 2-Monats-Röntgenaufnahmen durchgeführt. In diese Analyse wurden nur Zähne mit interdentalen Bereichen mit parodontaler Krankheitsaktivität einbezogen. Veränderungen zwischen den Röntgenaufnahmen wurden als dunkler Bereich für den Verlust von Alveolarknochenmasse dargestellt. Diese Flächen wurden mithilfe einer speziellen Messsoftware gemessen (mm2). Wie bei der klinischen Untersuchung wurde auch bei der Messung von Bereichen mit radiologischem Dichteverlust eine Intra-Untersucher-Kalibrierung durchgeführt.

Während der regulären parodontalen Chirurgie wurden bei jedem Patienten in beiden Gruppen Zahnfleischgewebeproben aus den aktiven Stellen entnommen. Anschließend wurde der herausgeschnittene Zahnfleischkragen vorsichtig von den Wurzeln und dem Alveolarfortsatz entfernt. Die Zahnfleischbiopsie umfasste Epithel- und Bindegewebe. Die Proben werden sofort in flüssigen Stickstoff getaucht und dann zur RNA-Extraktion und Genexpressionsanalyse bei -80 °C gelagert.

Die Gesamt-RNA aus Biopsien wurde mit dem Trizol-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Aus 1 µg Gesamt-RNA wurde durch eine Reverse-Transkriptionsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Strang komplementärer DNA (cDNA) synthetisiert. Am Ende dieser Reaktion wurde die cDNA zur späteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Das Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Array ermöglichte die gleichzeitige Analyse von 84 Genen, die an bestimmten Signalwegen beteiligt sind. Die in PCR-Array-Platten enthaltenen Gene für menschliche entzündliche Zytokine und Rezeptoren.