Biomarkery diagnostyczne związane z aktywnością chorób przyzębia u chorych na cukrzycę

To podłużne badanie kliniczno-kontrolne zostało przeprowadzone na Uniwersytecie w São Paulo w okresie od marca 2009 do czerwca 2012 jako wspólna współpraca Kliniki Chirurgii Jamy Ustnej i Periodontologii oraz Kliniki Chorób Wewnętrznych, Oddziału Endokrynologii i Metabolizmu. Został zweryfikowany i zatwierdzony przez Institutional Human Ethics Research Committee of Ribeirão School of Dentistry – University of Sao Paulo (proces nr 2009.1.88.58.7).

Kliniczny ubytek przyczepu powyżej 1 mm określono zgodnie z metodą tolerancji dostosowaną do komputerowej sondy periodontologicznej, biorąc pod uwagę odchylenie standardowe 0,3 mm dla sondy elektronicznej pomnożone przez 3. Nie brano pod uwagę zębów z protezą lub zmianami furkacyjnymi. Miejsca przyzębia, które miały ten kliniczny przyczep, nazwano miejscami aktywnymi.

Przed przystąpieniem do wstępnego badania klinicznego wykonano skaling naddziąsłowy urządzeniem ultradźwiękowym w celu ułatwienia badania. Ocenianymi parametrami klinicznymi były: głębokość kieszonek dziąsłowych, względny kliniczny poziom przyczepu i krwawienie podczas sondowania rejestrowane w sześciu miejscach na ząb za pomocą skomputeryzowanej sondy periodontologicznej. Aby zmniejszyć różnice między ocenami wyjściowymi i 12-miesięcznymi, zastosowano akrylowy stent w celu ujednolicenia pozycji skomputeryzowanej sondy periodontologicznej. Krwawienie podczas sondowania oceniano na podstawie obecności lub braku krwawienia do 20 sekund po sondowaniu. Wskaźnik płytki nazębnej, obecność lub brak biofilmu, rejestrowano w czterech miejscach na ząb. Zweryfikowano również zajęcie furkacji za pomocą manualnej sondy periodontologicznej.

Wszystkie parametry kliniczne rejestrowano dwa tygodnie po skalingu naddziąsłowym (linia wyjściowa) i dwa miesiące po niechirurgicznym leczeniu periodontologicznym przez skalibrowanego egzaminatora z jedną ślepą próbą. Wykonano ćwiczenie kalibracyjne w celu uzyskania akceptowalnej odtwarzalności wewnątrzbadającej.

W celu oceny wyrównania metabolicznego poziomy HbA1c analizowano u pacjentów z obu grup na początku badania i dwa miesiące po niechirurgicznym leczeniu periodontologicznym w Klinice Endokrynologii Szkoły Medycznej Ribeirão Preto Uniwersytetu w São Paulo. Wszyscy chorzy na cukrzycę byli pod nadzorem endokrynologa, któremu zalecono informowanie o wszelkich zmianach w przyjmowaniu leków lub diecie.

Program kontroli płytki nazębnej wraz z profilaktyką stomatologiczną i instruktażem higieny jamy ustnej oraz sesje scalingu i planowania korzeni przeprowadzał ten sam operator przy użyciu kiret i urządzenia ultradźwiękowego w grupach PD i PD+DM. Wszystkie procedury skalowania i planowania root zostały sprawdzone pod kątem drugiego operatora. Kontrolę higieny jamy ustnej przeprowadzono po tygodniu i po miesiącu dezynfekcji przyzębia, a następnie wykonano profilaktykę stomatologiczną.

W grupie PD+DM niechirurgiczne leczenie periodontologiczne było związane z ogólnoustrojową dawką 100 mg/dobę doksycykliny przez 2 tygodnie po dawce początkowej 200 mg, rozpoczętej w dniu poprzedzającym leczenie periodontologiczne. Pacjenci z grupy PD nie mieli dostępu do informacji o podawaniu antybiotyków pacjentom z grupy PD+DM.

Niestymulowaną całą odkrztuszoną ślinę pobrano (~ 3 ml) od każdego osobnika do sterylnych probówek. Badanym powstrzymywano się od jedzenia, picia i higieny jamy ustnej przez 2 godziny przed pobraniem śliny. Próbki śliny natychmiast umieszczono na lodzie i podzielono na porcje przed zamrożeniem w temperaturze -80°C. Próbki rozmrażano i analizowano w ciągu 6 miesięcy od pobrania.

U każdego pacjenta wykonano kompletną serię radiogramów na początku badania, stosując technikę równoległą. Dwa miesiące po leczeniu periodontologicznym wykonano zdjęcia rentgenowskie, tą samą techniką, w zębach z aktywnymi ogniskami przyzębia. Następnie zdjęcia rentgenowskie zostały zdigitalizowane w formacie TIFF (Tagged Image File Format) na skanerze. Cyfrowe radiogramy subtrakcyjne wykonano z podstawowymi i 2-miesięcznymi radiogramami przy użyciu specjalnego oprogramowania. Do tej analizy włączono tylko zęby z miejscami międzyzębowymi z aktywnością choroby przyzębia. Zmiany między radiogramami przedstawiono jako zaciemniony obszar utraty masy kostnej wyrostka zębodołowego. Obszary te zmierzono (mm2) przy użyciu specjalnego oprogramowania pomiarowego. Podobnie jak w badaniu klinicznym przeprowadzono kalibrację wewnątrzegzaminacyjną dla pomiarów obszarów ubytku gęstości radiograficznej.

Próbki tkanek dziąseł pobrano z miejsc aktywnych każdego pacjenta w obu grupach podczas regularnych zabiegów periodontologicznych. Wycięty kołnierz dziąsłowy został następnie ostrożnie usunięty z korzeni i wyrostka zębodołowego. Biopsja dziąsła obejmowała tkankę nabłonkową i łączną. Próbki są natychmiast zanurzane w ciekłym azocie, a następnie przechowywane w temperaturze -80°C w celu ekstrakcji RNA i analizy ekspresji genów.

Całkowity RNA z biopsji ekstrahowano odczynnikiem Trizol zgodnie z zaleceniami producenta. Z 1 µg całkowitego RNA zsyntetyzowano nić komplementarnego DNA (cDNA) poprzez reakcję odwrotnej transkrypcji zgodnie ze wskazówkami dostarczonymi przez producenta. Pod koniec tej reakcji cDNA przechowywano w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania. Macierz reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) umożliwiła jednoczesną analizę 84 genów zaangażowanych w określone szlaki sygnałowe. Geny zawarte w płytkach PCR array dla ludzkich cytokin zapalnych i receptorów.