Diagnostische biomarkers gerelateerd aan activiteit van parodontitis bij diabetes

Deze case-control longitudinale studie werd uitgevoerd aan de Universiteit van São Paulo tussen maart 2009 en juni 2012 als een gezamenlijke samenwerking van de Afdeling Kaakchirurgie en Parodontologie en de Afdeling Interne Geneeskunde, Afdeling Endocrinologie en Metabolisme. Het werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Human Ethics Research Committee van de Ribeirão School of Dentistry - University of Sao Paulo (proces nr. 2009.1.88.58.7).

Het klinische aanhechtingsverlies boven 1 mm werd bepaald volgens de tolerantiemethode aangepast aan de gecomputeriseerde parodontale sonde, rekening houdend met de standaarddeviatie van 0,3 mm voor de elektronische sonde vermenigvuldigd met 3. Tanden met prothese- of furcatielaesies werden niet in aanmerking genomen. De parodontale sites die deze klinische aanhechting hadden, werden actieve sites genoemd.

Voordat met het eerste klinische onderzoek werd begonnen, werd een supragingivale schilfering met een ultrasoon apparaat uitgevoerd om het onderzoek te vergemakkelijken. De geëvalueerde klinische parameters waren: diepte van de sondeerpocket, relatief klinisch hechtingsniveau en bloeding bij sonderen werden geregistreerd op zes plaatsen per tand met behulp van een gecomputeriseerde parodontale sonde. Om de variaties tussen basislijn en 12-maanden evaluaties te verminderen, werd een acryl stent gebruikt om de positie van de gecomputeriseerde parodontale sonde te standaardiseren. Bloeden bij sonderen werd beoordeeld op basis van de aan- of afwezigheid van bloeden tot 20 seconden na sonderen. De plaque-index, aanwezigheid of afwezigheid van biofilm, werd geregistreerd op vier plaatsen per tand. Ook werd de betrokkenheid van de furcatie geverifieerd met behulp van een handmatige parodontale sonde.

Alle klinische parameters werden twee weken na supragingivale scaling (baseline) en twee maanden na niet-chirurgische parodontale therapie geregistreerd door een geblindeerde, gekalibreerde onderzoeker. Er werd een kalibratieoefening uitgevoerd om een ​​acceptabele reproduceerbaarheid binnen de onderzoeker te bereiken.

Voor de beoordeling van de metabole controle werden de HbA1c-waarden geanalyseerd bij patiënten uit beide groepen bij aanvang en twee maanden na niet-chirurgische parodontale therapie, in de Endocrinologiekliniek van de Ribeirão Preto School of Medicine, Universiteit van São Paulo. Alle diabetici stonden onder supervisie van een endocrinoloog die werd geadviseerd om elke verandering in de inname van medicijnen of het dieet te melden.

Een programma van plaquecontrole met tandheelkundige profylaxe en instructies voor mondhygiëne, en de scaling- en wortelplanningsessies werden uitgevoerd door dezelfde operator met behulp van curettes en een ultrasoon apparaat in PD- en PD+DM-groepen. Voor een tweede operator werden alle schalings- en rootplanningprocedures geïnspecteerd. Mondhygiëne werd beoordeeld na een week en na een maand parodontale desinfectie, gevolgd door tandheelkundige profylaxe.

In de PD+DM-groep werd de niet-chirurgische parodontale therapie geassocieerd met systemische doxycycline 100 mg/dag, gedurende twee weken na een initiële dosis van 200 mg, gestart op de dag vóór de parodontale therapie. Patiënten van de PD-groep hadden geen toegang tot informatie over antibioticatoediening aan patiënten van de PD+DM-groep.

Niet-gestimuleerd volledig opgehoest speeksel werd verzameld (~ 3 ml) van elke proefpersoon in steriele buisjes. De proefpersonen mochten 2 uur voorafgaand aan de speekselverzameling niet eten, drinken en mondhygiëne houden. Speekselmonsters werden onmiddellijk op ijs geplaatst en in porties verdeeld voordat ze werden ingevroren bij -80º Celsius. Monsters werden binnen 6 maanden na verzameling ontdooid en geanalyseerd.

Bij elke patiënt werd bij aanvang een volledige reeks röntgenfoto's gemaakt met behulp van de parallelling-techniek. Twee maanden na parodontale therapie werden met dezelfde techniek röntgenfoto's gemaakt van tanden met actieve parodontale plaatsen. Daarna werden de röntgenfoto's gedigitaliseerd in tagged image file format (TIFF) op een scanner. Er werden digitale subtractie-röntgenfoto's gemaakt met de basislijn- en 2-maands-röntgenfoto's met behulp van specifieke software. Alleen tanden met interproximale plaatsen met parodontitisactiviteit werden in deze analyse opgenomen. Veranderingen tussen röntgenfoto's werden afgebeeld als een donker gebied voor verlies van alveolaire botmassa. Deze gebieden werden gemeten (mm2) met behulp van specifieke meetsoftware. Net als bij het klinisch onderzoek, werd het binnen de onderzoeker gekalibreerd voor de metingen van gebieden met radiografisch densiteitsverlies.

Gingivale weefselmonsters werden verkregen van actieve plaatsen van elke patiënt in beide groepen tijdens reguliere parodontale chirurgie. De uitgesneden gingivale kraag werd vervolgens voorzichtig verwijderd van de wortels en het alveolaire proces. Tandvleesbiopsie omvatte epitheel- en bindweefsel. De monsters worden onmiddellijk ondergedompeld in vloeibare stikstof en vervolgens opgeslagen bij -80º Celsius voor RNA-extractie en analyse van genexpressie.

Totaal RNA uit biopsieën werd geëxtraheerd met behulp van het Trizol-reagens volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Van 1 µg totaal RNA werd een streng complementair DNA (cDNA) gesynthetiseerd via een omgekeerde transcriptiereactie volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Aan het einde van deze reactie werd cDNA bewaard bij -20º Celsius voor later gebruik. De Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Array maakte gelijktijdige analyse mogelijk van 84 genen die betrokken zijn bij specifieke signaalroutes. De genen die zijn opgenomen in PCR-arrayplaten voor menselijke inflammatoire cytokines en receptoren.