Diagnostické biomarkery související s aktivitou onemocnění parodontu u diabetiků

Tato případová-kontrolní longitudinální studie byla provedena na univerzitě v São Paulu mezi březnem 2009 a červnem 2012 jako společná spolupráce Kliniky ústní chirurgie a parodontologie a Kliniky vnitřního lékařství, Divize endokrinologie a metabolismu. Byla přezkoumána a schválena Institutional Human Ethics Research Committee of Ribeirão School of Dentistry - University of Sao Paulo (proces č. 2009.1.88.58.7).

Klinická ztráta úponu nad 1 mm byla stanovena podle toleranční metody přizpůsobené počítačové periodontální sondě s uvážením směrodatné odchylky 0,3 mm pro elektronickou sondu vynásobené 3. Zuby s protézou nebo s furkačními lézemi nebyly brány v úvahu. Parodontální místa, která měla toto klinické připojení, se nazývala aktivní místa.

Před zahájením vstupního klinického vyšetření bylo provedeno supragingivální škálování ultrazvukovým přístrojem pro usnadnění vyšetření. Hodnocené klinické parametry byly: hloubka kapsy sondy, relativní úroveň klinického připojení a krvácení při sondování byly zaznamenány na šesti místech na zub pomocí počítačové periodontální sondy. Aby se snížily rozdíly mezi výchozím a 12měsíčním hodnocením, byl ke standardizaci polohy počítačové periodontální sondy použit akrylový stent. Krvácení při sondování bylo hodnoceno podle přítomnosti nebo nepřítomnosti krvácení do 20 sekund po sondování. Index plaku, přítomnost nebo nepřítomnost biofilmu, byl zaznamenán na čtyřech místech na zub. Pomocí ruční periodontální sondy bylo také ověřeno postižení furkace.

Všechny klinické parametry byly zaznamenávány dva týdny po supragingiválním škálování (základní hodnota) a dva měsíce po nechirurgické parodontální terapii zaslepeným kalibrovaným vyšetřovatelem. Bylo provedeno kalibrační cvičení pro dosažení přijatelné reprodukovatelnosti intraexamineru.

Pro hodnocení metabolické kontroly byly hladiny HbA1c analyzovány u pacientů z obou skupin na začátku studie a dva měsíce po nechirurgické parodontální terapii na endokrinologické klinice Lékařské fakulty Ribeirão Preto, University of São Paulo. Všichni diabetici byli pod dohledem endokrinologa, kterému bylo doporučeno sdělit jakoukoli změnu v příjmu léků nebo dietě.

Program kontroly plaku s dentální profylaxí a instruktáží o ústní hygieně a sezení škálování a plánování kořenů prováděl stejný operátor pomocí kyret a ultrazvukového zařízení ve skupinách PD a PD+DM. Všechny postupy škálování a kořenového plánování byly zkontrolovány pro druhého operátora. Ústní hygiena byla revidována po týdnu a po měsíci parodontální dezinfekce s následnou dentální profylaxií.

Ve skupině PD+DM byla nechirurgická parodontologická terapie spojena se systémovým doxycyklinem 100 mg/den, po dobu dvou týdnů po úvodní dávce 200 mg, zahájené den před periodontální terapií. Pacienti ve skupině PD neměli přístup k informacím o podávání antibiotik pacientům ze skupiny PD+DM.

Nestimulované celé expektorované sliny byly odebrány (~ 3 ml) od každého subjektu do sterilních zkumavek. Subjekty se zdržely jídla, pití a ústní hygieny po dobu 2 hodin před odběrem slin. Vzorky slin byly ihned umístěny na led a rozděleny na alikvoty před zmrazením při -80 °C. Vzorky byly rozmraženy a analyzovány do 6 měsíců od odběru.

U každého pacienta byla na začátku pořízena kompletní série rentgenových snímků za použití paralelní techniky. Dva měsíce po parodontální terapii byly stejnou technikou provedeny rentgenové snímky zubů s aktivními periodontálními místy. Poté byly rentgenové snímky digitalizovány ve formátu označeného obrazového souboru (TIFF) na skeneru. Digitální subtrakční rentgenové snímky byly provedeny se základními a 2měsíčními rentgenovými snímky pomocí specifického softwaru. Do této analýzy byly zahrnuty pouze zuby s interproximálními místy s aktivitou periodontálního onemocnění. Změny mezi rentgenovými snímky byly znázorněny jako ztmavená oblast pro ztrátu alveolární kostní hmoty. Tyto plochy byly měřeny (mm2) pomocí specifického měřicího softwaru. Stejně jako u klinického vyšetření byla provedena intra-vyšetřovací kalibrace pro měření oblastí radiografické ztráty hustoty.

Vzorky gingivální tkáně byly získány z aktivních míst každého pacienta v obou skupinách během pravidelné periodontální chirurgie. Vyříznutý gingivální límec byl poté opatrně odstraněn z kořenů a alveolárního výběžku. Gingivální biopsie zahrnovala epiteliální a pojivové tkáně. Vzorky jsou okamžitě ponořeny do kapalného dusíku, aby byly poté uloženy při -80º Celsia pro extrakci RNA a analýzu genové exprese.

Celková RNA z biopsií byla extrahována pomocí činidla Trizol podle pokynů dodaných výrobcem. Z 1 ug celkové RNA byl syntetizován řetězec komplementární DNA (cDNA) pomocí reakce reverzní transkripce podle pokynů dodaných výrobcem. Na konci této reakce byla cDNA uložena při -20 °C pro pozdější použití. Pole polymerázové řetězové reakce v reálném čase (PCR) umožnilo simultánní analýzu 84 genů zapojených do specifických signálních drah. Geny zahrnuté v PCR čipových destičkách pro lidské zánětlivé cytokiny a receptory.