Biomarcatori diagnostici correlati all'attività della malattia parodontale nei diabetici

Questo studio longitudinale caso-controllo è stato condotto presso l'Università di San Paolo tra marzo 2009 e giugno 2012 come collaborazione congiunta del Dipartimento di Chirurgia Orale e Parodontologia e del Dipartimento di Medicina Interna, Divisione di Endocrinologia e Metabolismo. È stato esaminato e approvato dal Comitato istituzionale di ricerca sull'etica umana della Ribeirão School of Dentistry - University of Sao Paulo (processo n. 2009.1.88.58.7).

La perdita clinica di attacco superiore a 1 mm è stata determinata secondo il metodo di tolleranza adattato alla sonda parodontale computerizzata, considerando la deviazione standard di 0,3 mm per la sonda elettronica moltiplicata per 3. Non sono stati considerati i denti con lesioni protesiche o di forcazione. I siti parodontali che presentavano questo attacco clinico erano chiamati siti attivi.

Prima di iniziare l'esame clinico iniziale, è stato eseguito un ablazione sopragengivale con dispositivo ad ultrasuoni per facilitare l'esame. I parametri clinici valutati sono stati: la profondità della tasca al sondaggio, il relativo livello di attacco clinico e il sanguinamento al sondaggio sono stati registrati in sei siti per dente con l'ausilio di una sonda parodontale computerizzata. Per ridurre le variazioni tra le valutazioni basali e quelle a 12 mesi, è stato utilizzato uno stent acrilico per standardizzare la posizione della sonda parodontale computerizzata. Il sanguinamento al sondaggio è stato valutato in base alla presenza o assenza di sanguinamento fino a 20 secondi dopo il sondaggio. L'indice di placca, presenza o assenza di biofilm, è stato registrato in quattro siti per dente. È stato inoltre verificato il coinvolgimento della forcazione con l'ausilio di una sonda parodontale manuale.

Tutti i parametri clinici sono stati registrati due settimane dopo lo scaling sopragengivale (basale) e due mesi dopo la terapia parodontale non chirurgica da un esaminatore calibrato in cieco. È stato eseguito un esercizio di calibrazione per ottenere una riproducibilità intraesaminatore accettabile.

Per la valutazione del controllo metabolico, i livelli di HbA1c sono stati analizzati in pazienti di entrambi i gruppi al basale e due mesi dopo la terapia parodontale non chirurgica, presso la Clinica Endocrinologica della Facoltà di Medicina Ribeirão Preto, Università di San Paolo. Tutti i diabetici erano sotto la supervisione di un endocrinologo consigliato di comunicare qualsiasi cambiamento nell'assunzione di farmaci o nella dieta.

Un programma di controllo della placca con profilassi dentale e istruzione di igiene orale, e le sessioni di detartrasi e levigatura radicolare sono state eseguite dallo stesso operatore utilizzando curette e un dispositivo a ultrasuoni nei gruppi PD e PD+DM. Tutte le procedure di scaling e root planning sono state ispezionate per un secondo operatore. L'igiene orale è stata rivista dopo una settimana e dopo un mese di disinfezione parodontale, seguita dalla profilassi dentale.

Nel gruppo PD+DM, la terapia parodontale non chirurgica è stata associata a doxiciclina sistemica 100 mg/die, per due settimane dopo una dose iniziale di 200 mg, iniziata il giorno prima della terapia parodontale. I pazienti del gruppo PD non avevano accesso alle informazioni sulla somministrazione di antibiotici ai pazienti del gruppo PD+DM.

La saliva espettorata intera non stimolata è stata raccolta (~ 3 ml) da ciascun soggetto in provette sterili. I soggetti si sono astenuti dal mangiare, dal bere e dall'igiene orale per 2 ore prima della raccolta della saliva. I campioni di saliva sono stati posti immediatamente su ghiaccio e aliquotati prima del congelamento a -80º Celsius. I campioni sono stati scongelati e analizzati entro 6 mesi dalla raccolta.

Una serie completa di radiografie è stata presa in ogni paziente al basale, utilizzando la tecnica parallela. Due mesi dopo la terapia parodontale, sono state eseguite radiografie con la stessa tecnica su denti con siti parodontali attivi. Successivamente, le radiografie sono state digitalizzate in formato TIFF (tagged image file) su uno scanner. Le radiografie di sottrazione digitale sono state eseguite con la linea di base e le radiografie a 2 mesi utilizzando un software specifico. In questa analisi sono stati inclusi solo i denti con siti interprossimali con attività di malattia parodontale. I cambiamenti tra le radiografie sono stati rappresentati come un'area oscurata per la perdita di massa ossea alveolare. Queste aree sono state misurate (mm2) utilizzando uno specifico software di misurazione. Come nell'esame clinico, è stata eseguita la calibrazione intraesaminatore per le misurazioni delle aree di perdita di densità radiografica.

I campioni di tessuto gengivale sono stati ottenuti dai siti attivi di ciascun paziente in entrambi i gruppi durante la normale chirurgia parodontale. Il collare gengivale asportato è stato quindi accuratamente rimosso dalle radici e dal processo alveolare. La biopsia gengivale comprendeva tessuti epiteliali e connettivi. I campioni vengono immediatamente immersi in azoto liquido per poi essere conservati a -80º Celsius per l'estrazione dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica.

L'RNA totale dalle biopsie è stato estratto utilizzando il reagente Trizol secondo le indicazioni fornite dal produttore. Da 1 µg di RNA totale è stato sintetizzato un filamento di DNA complementare (cDNA) attraverso una reazione di trascrizione inversa secondo le indicazioni fornite dal produttore. Al termine di questa reazione, il cDNA è stato conservato a -20º Celsius per un uso successivo. L'array PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction) ha consentito l'analisi simultanea di 84 geni coinvolti in specifici percorsi di segnalazione. I geni inclusi nelle piastre dell'array PCR per citochine e recettori infiammatori umani.