Biomarcadores de diagnóstico relacionados à atividade da doença periodontal em diabéticos

Este estudo longitudinal de caso-controle foi realizado na Universidade de São Paulo entre março de 2009 e junho de 2012 como uma colaboração conjunta do Departamento de Cirurgia Oral e Periodontologia e do Departamento de Clínica Médica da Divisão de Endocrinologia e Metabolismo. Foi analisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Ética em Pesquisa Humana da Faculdade de Odontologia de Ribeirão - Universidade de São Paulo (processo n. 2009.1.88.58.7).

A perda de inserção clínica acima de 1 mm foi determinada de acordo com o método de tolerância adaptado à sonda periodontal computadorizada, considerando o desvio padrão de 0,3 mm para a sonda eletrônica multiplicado por 3. Dentes com próteses ou lesões de furca não foram considerados. Os sítios periodontais que apresentavam essa inserção clínica foram chamados de sítios ativos.

Antes de iniciar o exame clínico inicial, foi realizada raspagem supragengival com aparelho ultrassônico para facilitar o exame. Os parâmetros clínicos avaliados foram: profundidade de bolsa de sondagem, nível de inserção clínico relativo e sangramento à sondagem foram registrados em seis locais por dente com o auxílio de uma sonda periodontal computadorizada. Para reduzir as variações entre as avaliações iniciais e de 12 meses, um stent de acrílico foi usado para padronizar a posição da sonda periodontal computadorizada. O sangramento à sondagem foi avaliado de acordo com a presença ou ausência de sangramento até 20 segundos após a sondagem. O índice de placa, presença ou ausência de biofilme, foi registrado em quatro locais por dente. Também foi verificado o acometimento de furca com auxílio de sonda periodontal manual.

Todos os parâmetros clínicos foram registrados duas semanas após a raspagem supragengival (linha de base) e dois meses após a terapia periodontal não cirúrgica por um examinador calibrado e cego. Um exercício de calibração foi realizado para obter reprodutibilidade intraexaminador aceitável.

Para a avaliação do controle metabólico, os níveis de HbA1c foram analisados ​​em pacientes de ambos os grupos no início e dois meses após a terapia periodontal não cirúrgica, na Clínica de Endocrinologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Todos os diabéticos estavam sob supervisão de um endocrinologista orientado a comunicar qualquer alteração na ingestão de medicamentos ou dieta.

Um programa de controle de placa com profilaxia dentária e instrução de higiene oral, e as sessões de raspagem e alisamento radicular foram realizados pelo mesmo operador usando curetas e um aparelho ultrassônico nos grupos PD e PD+DM. Todos os procedimentos de raspagem e alisamento radicular foram inspecionados por um segundo operador. A higiene bucal foi revisada após uma semana e após um mês de desinfecção periodontal, seguida de profilaxia dentária.

No grupo DP+DM, a terapia periodontal não cirúrgica foi associada à doxiciclina sistêmica 100 mg/dia, por duas semanas após dose inicial de 200 mg, iniciada na véspera da terapia periodontal. Os pacientes do grupo DP não tiveram acesso à informação sobre a administração de antibióticos aos pacientes do grupo DP+DM.

Saliva expectorada total não estimulada foi coletada (~ 3 ml) de cada indivíduo em tubos estéreis. Os indivíduos foram abstidos de comer, beber e higiene oral por 2 horas antes da coleta de saliva. As amostras de saliva foram imediatamente colocadas em gelo e aliquotadas antes do congelamento a -80º Celsius. As amostras foram descongeladas e analisadas dentro de 6 meses após a coleta.

Uma série completa de radiografias foi feita em cada paciente no início do estudo, usando a técnica de paralelismo. Dois meses após a terapia periodontal, radiografias foram feitas com a mesma técnica em dentes com sítios periodontais ativos. Em seguida, as radiografias foram digitalizadas em formato de arquivo de imagem marcada (TIFF) em um scanner. Radiografias de subtração digital foram realizadas com a linha de base e radiografias de 2 meses usando software específico. Apenas dentes com sítios interproximais com atividade de doença periodontal foram incluídos nesta análise. Alterações entre as radiografias foram descritas como uma área escurecida para perda de massa óssea alveolar. Essas áreas foram medidas (mm2) por meio de um software de medição específico. Assim como no exame clínico, foi realizada a calibração intra-examinador para as medidas das áreas de perda de densidade radiográfica.

Amostras de tecido gengival foram obtidas de locais ativos de cada paciente em ambos os grupos durante a cirurgia periodontal regular. O colar gengival excisado foi cuidadosamente removido das raízes e do processo alveolar. A biópsia gengival compreendeu tecidos epiteliais e conjuntivos. As amostras são imediatamente submersas em nitrogênio líquido para serem armazenadas a -80º Celsius para extração de RNA e análise de expressão gênica.

O RNA total das biópsias foi extraído usando o reagente Trizol de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. A partir de 1 µg de RNA total, uma fita de DNA complementar (cDNA) foi sintetizada por meio de uma reação de transcrição reversa de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Ao final desta reação, o cDNA foi armazenado a -20º Celsius para uso posterior. O Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Array permitiu a análise simultânea de 84 genes envolvidos em vias de sinalização específicas. Os genes incluídos nas placas de arranjo de PCR para citocinas e receptores inflamatórios humanos.