Intraoperativa prostata Loge-biopsier (iPROLOGX) efter radikal prostatovesikulktomi (iPROLOGX)

Detta projekt handlar om detektion av ockulta tumörceller i kirurgiska marginaler av radikal prostatovesikulktomi genom att analysera metyleringsstatusen för Glutation S-transferas P 1 (GSTP1). Efter körtelexcision erhålls prover från 9 definierade områden av prostatafossa. Biopsierna är uppdelade i två delar. En del används för histopatologisk analys och den andra delen för molekylärgenetisk analys. Resultat kommer att korreleras t.ex. med tumörstadium, Gleason Score och prostataspecifikt antigen (PSA).

Den prostatacancer-negativa kontrollgruppen med cancer i urinblåsan.

DNA ISOLERING

DNA från biopsier lagrade vid -80°C isolerades genom att använda innuPREP DNA mini Kit (Analytik Jena, Jena, Tyskland) enligt protokoll 1 i tillverkarens instruktioner. DNA eluerades med 50 ul elueringsbuffert. Koncentration och renhet analyserades med hjälp av Nanodrop 2000.

DNA BISULFITE MODIFIKATION

DNA modifierades genom att använda EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Prover eluerades en gång med 20 ul elueringsbuffert.

KVANTITATIV METYLERINGSPECIFIK PCR

Metyleringsstatus för GSTP1 analyseras med kvantitativ metyleringsspecifik PCR (Q-MSP) med StepOnePlus Real-Time PCR System och StepOne Software v2.1 från Applied Biosystems (Darmstadt, Tyskland). Q-MSP utfördes i dubbelanalys av gener Actin och GSTP1. Sekvenserna för primrarna och testproberna som användes för att amplifiera och detektera hypermetylerad GSTP1 var: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (framåtriktad primer), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (omvänd primer) och 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg), (märkt med FLUORc) Sekvenserna för primrarna och testproberna som användes för att amplifiera och detektera aktin var: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (framåtriktad primer), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (omvänd primer),5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA, märkt med dyman med V-prober, (taq.

Q-MSP utfördes vid 50°C under 2 minuter, 95°C under 15 minuter. följt av 50 cykler av 95°C i 1 s och 60°C i 1 min. Som en positiv kontroll användes bisulfit-konverterad DNA av DU145 och LNCap. Blanka reaktioner med destillerat vatten, som ersatte DNA, fungerade som negativ kontroll (NTC).