Intraoperationele prostaat loge biopsies (iPROLOGX) na radicale prostatovesiculectomie (iPROLOGX)

Dit project gaat over de detectie van occulte tumorcellen in chirurgische marges van radicale prostatovesiculectomie door de methyleringsstatus van glutathione S-transferase P 1 (GSTP1) te analyseren. Na excisie van de klier worden monsters verkregen uit 9 gedefinieerde gebieden van de fossa prostaat. De biopten zijn verdeeld in twee delen. Een deel gebruikt voor histopathologische analyse en het andere deel voor moleculairgenetische analyse. Resultaten zullen worden gecorreleerd, b.v. met tumorstadium, Gleason-score en prostaatspecifiek antigeen (PSA).

De prostaatkanker-negatieve controlegroep met blaaskanker.

DNA ISOLATIE

DNA uit biopsieën die bij -80 °C waren bewaard, werd geïsoleerd met behulp van innuPREP DNA mini Kit (Analytik Jena, Jena, Duitsland) volgens protocol 1 van de instructies van de fabrikant. DNA werd geëlueerd met 50 µl elutiebuffer. Concentratie en zuiverheid werden geanalyseerd met behulp van Nanodrop 2000.

DNA BISULFITE MODIFICATIE

DNA werd gemodificeerd met behulp van EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden eenmaal geëlueerd met 20 µl elutiebuffer.

KWANTITATIEVE METHYLATIESPECIFIEKE PCR

De methylatiestatus van GSTP1 wordt geanalyseerd door middel van kwantitatieve methylatiespecifieke PCR (Q-MSP) met behulp van StepOnePlus Real-Time PCR System en StepOne Software v2.1 van Applied Biosystems (Darmstadt, Duitsland). Q-MSP werd in duplo uitgevoerd waarbij de genen Actin en GSTP1 werden geanalyseerd. De sequenties van de primers en testprobes die werden gebruikt om gehypermethyleerd GSTP1 te amplificeren en te detecteren, waren: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (forward primer), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (reverse primer) en 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (taqman-probe), gelabeld met fluorescentiekleurstof FAM. De sequenties van de primers en testprobes die werden gebruikt om Actine te amplificeren en te detecteren, waren: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (forward primer), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (reverse primer), 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (taqman-probe), gelabeld met fluorescentiekleurstof VIC.

De Q-MSP werd uitgevoerd bij 50°C gedurende 2 min., 95°C gedurende 15 min. gevolgd door 50 cycli van 95°C gedurende 1 s en 60°C gedurende 1 minuut. Als positieve controle werd bisulfiet-geconverteerd DNA van DU145 en LNCap gebruikt. Blanco reacties met gedestilleerd water, dat DNA verving, dienden als negatieve controle (NTC).