Biópsias Loge Prostáticas Intraoperatórias (iPROLOGX) Após Prostatovesiculectomia Radical (iPROLOGX)

Este projeto trata da detecção de células tumorais ocultas em margens cirúrgicas de prostatovesiculectomia radical por meio da análise do estado de metilação da Glutationa S-transferase P 1 (GSTP1). Após a excisão da glândula, as amostras são obtidas de 9 áreas definidas da fossa prostática. As biópsias são divididas em duas partes. Uma parte utilizada para análise histopatológica e a outra parte para análise moleculargenética. Os resultados serão correlacionados, por ex. com estágio tumoral, Gleason Score e antígeno prostático específico (PSA).

O grupo de controle negativo para câncer de próstata com câncer de bexiga.

ISOLAMENTO DE DNA

O DNA das biópsias armazenadas a -80°C foi isolado usando o kit innuPREP DNA mini (Analytik Jena, Jena, Alemanha) seguindo o protocolo 1 das instruções do fabricante. O DNA foi eluído com 50 µl de tampão de eluição. A concentração e a pureza foram analisadas usando o Nanodrop 2000.

MODIFICAÇÃO DE BISULFITO DE DNA

O DNA foi modificado usando EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram eluídas uma vez com 20 µl de tampão de eluição.

PCR ESPECÍFICO DE METILAÇÃO QUANTITATIVA

O status de metilação de GSTP1 é analisado por PCR específico de metilação quantitativa (Q-MSP) usando o sistema StepOnePlus Real-Time PCR e o software StepOne v2.1 da Applied Biosystems (Darmstadt, Alemanha). A Q-MSP foi realizada em duplicata analisando os genes Actina e GSTP1. As sequências de primers e sondas de teste usadas para amplificar e detectar GSTP1 hipermetilado foram: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (primeiro direto), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (iniciador reverso) e 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (sonda taqman), marcados com corante fluorescente FAM. As sequências dos primers e das sondas de teste usadas para amplificar e detectar a actina foram: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (primer direto), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (iniciador reverso), 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (sonda taqman), marcado com corante fluorescente VIC.

O Q-MSP foi realizado a 50°C por 2 min., 95°C por 15 min. seguido de 50 ciclos de 95°C por 1s e 60°C por 1 min. Como um controle positivo DNA convertido em bissulfito de DU145 e LNCap foram usados. As reações em branco com água destilada, que substituiu o DNA, serviram como controle negativo (NTC).