Biopsias Loge de próstata intraoperatorias (iPROLOGX) después de una prostatovesiculectomía radical (iPROLOGX)

Este proyecto trata sobre la detección de células tumorales ocultas en márgenes quirúrgicos de prostatovesiculectomía radical mediante el análisis del estado de metilación de la Glutatión S-transferasa P 1 (GSTP1). Después de la escisión de la glándula, se obtienen muestras de 9 áreas definidas de la fosa prostática. Las biopsias se dividen en dos partes. Una parte se utiliza para el análisis histopatológico y la otra parte para el análisis genético molecular. Los resultados se correlacionarán, p. con estadio tumoral, Gleason Score y antígeno prostático específico (PSA).

El grupo de control negativo para cáncer de próstata con cáncer de vejiga.

AISLAMIENTO DE ADN

El ADN de las biopsias almacenadas a -80 °C se aisló utilizando el kit innuPREP DNA mini (Analytik Jena, Jena, Alemania) siguiendo el protocolo 1 de las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó con 50 µl de tampón de elución. La concentración y la pureza se analizaron utilizando Nanodrop 2000.

MODIFICACIÓN DE BISULFITO DE ADN

El ADN se modificó utilizando el kit de bisulfito EpiTect (QIAGEN, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se eluyeron una vez con 20 µl de tampón de elución.

PCR ESPECÍFICA DE METILACIÓN CUANTITATIVA

El estado de metilación de GSTP1 se analiza mediante PCR específica de metilación cuantitativa (Q-MSP) utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus y el software StepOne v2.1 de Applied Biosystems (Darmstadt, Alemania). Q-MSP se realizó por duplicado analizando los genes Actina y GSTP1. Las secuencias de los cebadores y las sondas de prueba utilizadas para amplificar y detectar GSTP1 hipermetilado fueron: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (cebador directo), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (cebador inverso) y 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (sonda taqman), marcadas con colorante fluorescente FAM. Las secuencias de los cebadores y las sondas de prueba utilizadas para amplificar y detectar actina fueron: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (cebador directo), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (cebador inverso), 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (sonda taqman), marcado con colorante fluorescente VIC.

La Q-MSP se llevó a cabo a 50°C durante 2 min., 95°C durante 15 min. seguido de 50 ciclos de 95°C por 1s y 60°C por 1 min. Como control positivo se usaron ADN convertido con bisulfito de DU145 y LNCap. Las reacciones en blanco con agua destilada, que reemplazó al ADN, sirvieron como control negativo (NTC).