Biopsies intra-opératoires de la loge prostatique (iPROLOGX) après prostatovésicectomie radicale (iPROLOGX)

Ce projet porte sur la détection de cellules tumorales occultes dans les marges chirurgicales d'une prostatovésicectomie radicale en analysant le statut de méthylation de la glutathion S-transférase P 1 (GSTP1). Après l'excision de la glande, des échantillons sont obtenus à partir de 9 zones définies de la fosse prostatique. Les biopsies sont divisées en deux parties. Une partie utilisée pour l'analyse histopathologique et l'autre partie pour l'analyse génétique moléculaire. Les résultats seront corrélés, par ex. avec le stade tumoral, le score de Gleason et l'antigène spécifique de la prostate (PSA).

Le groupe témoin sans cancer de la prostate atteint d'un cancer de la vessie.

ISOLATION DE L'ADN

L'ADN des biopsies stockées à -80°C a été isolé à l'aide du kit innuPREP DNA mini (Analytik Jena, Jena, Allemagne) en suivant le protocole 1 des instructions du fabricant. L'ADN a été élué avec 50 ul de tampon d'élution. La concentration et la pureté ont été analysées à l'aide de Nanodrop 2000.

MODIFICATION ADN BISULFITE

L'ADN a été modifié en utilisant le kit EpiTect Bisulfite (QIAGEN, Hilden, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. Les échantillons ont été élues une fois avec 20 ul de tampon d'élution.

PCR SPÉCIFIQUE À LA MÉTHYLATION QUANTITATIVE

L'état de méthylation de GSTP1 est analysé par PCR quantitative spécifique à la méthylation (Q-MSP) à l'aide du système de PCR en temps réel StepOnePlus et du logiciel StepOne v2.1 d'Applied Biosystems (Darmstadt, Allemagne). Q-MSP a été réalisée en double en analysant les gènes Actine et GSTP1. Les séquences des amorces et des sondes de test utilisées pour amplifier et détecter la GSTP1 hyperméthylée étaient : 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (amorce directe), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (amorce inverse) et 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (sonde taqman), marquées avec un colorant fluorescent FAM. Les séquences des amorces et des sondes de test utilisées pour amplifier et détecter l'actine étaient : 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (amorce directe), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (amorce inverse), 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (sonde taqman), marquées avec le colorant fluorescent VIC.

Le Q-MSP a été réalisé à 50°C pendant 2 min., 95°C pendant 15 min. suivi de 50 cycles de 95°C pendant 1s et 60°C pendant 1 min. Comme témoin positif, l'ADN converti au bisulfite de DU145 et de LNCap a été utilisé. Les réactions à blanc avec de l'eau distillée, qui a remplacé l'ADN, ont servi de contrôle négatif (NTC).