Intraoperative prostata Loge biopsier (iPROLOGX) efter radikal prostatovesikulktomi (iPROLOGX)

Dette projekt handler om påvisning af okkulte tumorceller i kirurgiske marginer af radikal prostatovesikulktomi ved at analysere methyleringsstatus for Glutathion S-transferase P 1 (GSTP1). Efter kirteludskæring udtages prøver fra 9 definerede områder af prostatafossa. Biopsierne er opdelt i to dele. Den ene del bruges til histopatologisk analyse og den anden del til molekylærgenetisk analyse. Resultater vil blive korreleret f.eks. med tumorstadie, Gleason Score og prostataspecifikt antigen (PSA).

Den prostatakræft-negative kontrolgruppe med blærekræft.

DNA ISOLERING

DNA fra biopsier opbevaret ved -80°C blev isoleret ved at bruge innuPREP DNA mini Kit (Analytik Jena, Jena, Tyskland) efter protokol 1 i producentens instruktioner. DNA blev elueret med 50 µl elueringsbuffer. Koncentration og renhed blev analyseret ved hjælp af Nanodrop 2000.

DNA BISULFIT MODIFIKATION

DNA blev modificeret ved at bruge EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. Prøver blev elueret én gang med 20 µl elueringsbuffer.

KVANTITATIV METHYLERINGSPECIFIK PCR

Methyleringsstatus for GSTP1 analyseres ved kvantitativ methyleringsspecifik PCR (Q-MSP) ved hjælp af StepOnePlus Real-Time PCR System og StepOne Software v2.1 fra Applied Biosystems (Darmstadt, Tyskland). Q-MSP blev udført i dobbeltanalyse af gener Actin og GSTP1. Primer- og testprobernes sekvenser, der blev brugt til at amplificere og detektere hypermethyleret GSTP1 var: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (forward primer), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (omvendt primer) og 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg, (mærket med FLUORc) Primernes og testprobernes sekvenser, der blev brugt til at amplificere og detektere Actin var: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (forward primer), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (revers primer),5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-mærket, (taq-dyman-mærket med VV-prober).

Q-MSP'en blev udført ved 50°C i 2 minutter, 95°C i 15 minutter. efterfulgt af 50 cyklusser på 95°C i 1 sekund og 60°C i 1 min. Som en positiv kontrol blev der anvendt bisulfit-konverteret DNA fra DU145 og LNCap. Blanke reaktioner med destilleret vand, som erstattede DNA, fungerede som negativ kontrol (NTC).