Интраоперационная биопсия простаты Loge (iPROLOGX) после радикальной простатовезикулоэктомии (iPROLOGX)

Этот проект посвящен обнаружению скрытых опухолевых клеток в хирургических краях радикальной простатовезикулоэктомии путем анализа статуса метилирования глутатион-S-трансферазы P 1 (GSTP1). После иссечения железы получают образцы из 9 определенных областей предстательной железы. Биопсия делится на две части. Одна часть используется для гистопатологического анализа, а другая часть для молекулярно-генетического анализа. Результаты будут коррелированы, например. со стадией опухоли, шкалой Глисона и специфическим антигеном простаты (ПСА).

Контрольная группа без рака простаты с раком мочевого пузыря.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

ДНК из биоптатов, хранившихся при температуре -80°C, выделяли с использованием мини-набора innuPREP DNA (Analytik Jena, Йена, Германия) в соответствии с протоколом 1 инструкций производителя. ДНК элюировали 50 мкл элюирующего буфера. Концентрацию и чистоту анализировали с помощью Nanodrop 2000.

БИСУЛЬФИТНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК

ДНК модифицировали с использованием набора EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы элюировали один раз 20 мкл элюирующего буфера.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПЦР

Статус метилирования GSTP1 анализируют с помощью количественной ПЦР, специфичной для метилирования (Q-MSP), с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOnePlus и программного обеспечения StepOne v2.1 от Applied Biosystems (Дармштадт, Германия). Q-MSP выполняли в дубликате, анализируя гены Actin и GSTP1. Последовательности праймеров и тестирующих зондов, используемых для амплификации и обнаружения гиперметилированного GSTP1, представляли собой: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (прямой праймер), 5'-gCCCCAATAACTAAATCACgACg (обратный праймер) и 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (зонд Такмана), меченный флуоресцентным красителем FAM. Последовательности праймеров и тестирующих зондов, используемых для амплификации и обнаружения актина, представляли собой: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (прямой праймер), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (обратный праймер), 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA (зонд Taqman), меченный флуоресцентным красителем VIC.

Q-MSP проводили при 50°С в течение 2 мин, 95°С в течение 15 мин. затем 50 циклов 95°С в течение 1 с и 60°С в течение 1 мин. В качестве положительного контроля использовали бисульфит-конвертированную ДНК DU145 и LNCap. Холостые реакции с дистиллированной водой, заменившей ДНК, служили отрицательным контролем (ОТК).