Intraoperative prostata Loge-biopsier (iPROLOGX) etter radikal prostatovesikulktomi (iPROLOGX)

Dette prosjektet handler om påvisning av okkulte tumorceller i kirurgiske marginer ved radikal prostatovesikulktomi ved å analysere metyleringsstatusen til Glutation S-transferase P 1 (GSTP1). Etter kjerteleksisjon tas prøver fra 9 definerte områder av prostatafossa. Biopsiene er delt inn i to deler. Den ene delen brukes til histopatologisk analyse og den andre delen til molekylærgenetisk analyse. Resultater vil korreleres f.eks. med tumorstadium, Gleason Score og prostataspesifikt antigen (PSA).

Den prostatakreft-negative kontrollgruppen med blærekreft.

DNA ISOLASJON

DNA fra biopsier lagret ved -80°C ble isolert ved å bruke innuPREP DNA mini Kit (Analytik Jena, Jena, Tyskland) etter protokoll 1 i produsentens instruksjoner. DNA ble eluert med 50 ul elueringsbuffer. Konsentrasjon og renhet ble analysert ved bruk av Nanodrop 2000.

DNA BISULFITE MODIFIKASJON

DNA ble modifisert ved å bruke EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Prøver ble eluert én gang med 20 ul elueringsbuffer.

KVANTITATIV METYLERINGSPESIFIK PCR

Metyleringsstatusen til GSTP1 analyseres ved kvantitativ metyleringsspesifikk PCR (Q-MSP) ved bruk av StepOnePlus Real-Time PCR System og StepOne Software v2.1 fra Applied Biosystems (Darmstadt, Tyskland). Q-MSP ble utført i duplikatanalyse av gener Actin og GSTP1. Sekvensene til primerne og testprobene som ble brukt til å amplifisere og påvise hypermetylert GSTP1 var: 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (forward primer), 5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (revers primer) og 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg, (merket med FLUORC). Sekvensene til primerne og testprobene som ble brukt til å amplifisere og påvise Actin var: 5'-TggTgATggAggAggTTTAgTAAgT (forward primer), 5'-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (revers primer),5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAA fluorescence), (taqence merket med VV-probe).

Q-MSP ble utført ved 50°C i 2 minutter, 95°C i 15 minutter. etterfulgt av 50 sykluser på 95°C i 1 s og 60°C i 1 min. Som en positiv kontroll ble bisulfitt-konvertert DNA fra DU145 og LNCap brukt. Blanke reaksjoner med destillert vann, som erstattet DNA, fungerte som negativ kontroll (NTC).