ERCP-inducerad och icke-ERCP-inducerad akut pankreatit: två distinkta kliniska och immunologiska enheter?

PROTOKOLL:

Alla patienter med indikation för endoskopisk retrograd kolangiopankreatografi (ERCP) kommer att förberedas för ERCP enligt följande protokoll: de kommer att instrueras att inte äta 4 till 6 timmar före proceduren. Omedelbart före proceduren kommer de att administreras med Diclophenac Sodium 100 mg suppositorier. En timme före ingreppet kommer 10 ml blodprov och urinprov att tas och analyseras i laboratorielokaler som ingår i University Hospital Center Rijeka för följande parametrar: värden av amylas i serum och urin och lipas i serum, leverenzymetester och njurfunktion. 4-6 timmar efter att ERCP har utförts kommer 10 ml blodprov att tas och analyseras i laboratorielokaler som ingår i University Hospital Center Rijeka för följande parametrar: värden av amylas i serum och urin och lipas i serum, leverenzymetester och njurfunktion .

24 timmar efter ingreppet kommer alla patienter att ta 30 ml hepariniserat perifert venöst blod och urinprov. 10 mL kommer att undersökas på Institutionen för laboratoriemedicin, Clinical Hospital Center för följande parametrar: värden av amylas i serum och urin och lipas i serum, leverenzymetester och njurfunktion. Urinprov som samlas in efter proceduren kommer att användas för att utvärdera amylasnivåer. Övriga 20 mL blodprover kommer att skickas till Institutionen för fysiologi och immunologi, School of Medicine där immunologisk analys kommer att utföras. Alla patienter som genomgått ERCP kommer att delas in i två grupper. Den första gruppen (PEP-gruppen) kommer att bestå av patienter som utvecklade akut pankreatit efter ERCP. Efter klinisk och laboratoriebekräftelse av akut pankreatit enligt European Society of Gastrointestinal Endoscopy (ESGE) riktlinjer för post-ERCP pankreatit, kommer att övervakas ytterligare under sjukhusvistelse för utvärdering av sjukdomens svårighetsgrad. Sjukdomens svårighetsgrad kommer att bedömas enligt Cotton-kriterierna för svårighetsgraden av post-ERCP pankreatit. Grupp av patienter som genomgick ERCP men inte utvecklade akut pankreatit inom 24 timmar efter proceduren kommer enligt ESGE:s riktlinjer att användas som kontrollgrupp (icke-PEP-grupp).

Alla patienter med akut pankreatit enligt Atlanta-kriterier som tagits in via akutmottagningen kommer att ta 30 ml hepariniserat perifert venöst blod och urinprov 24 timmar efter att de kliniska symtomen har börjat (smärta i övre delen av buken strålar ofta ut till ryggen). 10 mL insamlade blodprover kommer att undersökas på Institutionen för laboratoriemedicin, Clinical Hospital Center för följande parametrar: värden av amylas i serum och urin och lipas i serum, leverenzymetester och njurfunktion. Övriga 20 mL blodprover kommer att skickas till Institutionen för fysiologi och immunologi, School of Medicine där immunologisk analys kommer att utföras. Denna grupp av patienter kommer att övervakas ytterligare under sjukhusvistelse för utvärdering av sjukdomens svårighetsgrad. Sjukdomens svårighetsgrad kommer att bedömas enligt Atlanta-kriterierna.

METODER OCH MATERIAL

Laboratorieparametrar

För varje patient som ingår i studien kommer blod- och urinanalys att utföras på Institutionen för laboratoriemedicin, Clinical Hospital Center Rijeka. Grundläggande hematologiska tester kommer att omfatta: totalt blodvärde - en räkning av det totala antalet röda blodkroppar, vita blodkroppar och blodplättar som finns i blodet, värden på hemoglobin och hematokrit. Biokemisk analys av blodserum kommer att inkludera: värden av amylas och lipas i serum, natrium, kalium, glukos, leverenzymer (aspartataminotransferas (AST), alaninaminotransferas (ALT), Gama-glutamyltransferas (GGT), alkaliskt fosfatas (ALP) ) direkt och indirekt bilirubin, njurfunktion (serumurea och kreatinin, uppskattad glomerulär filtration (eGFR)), C-reaktivt protein och syra-basstatus i arteriellt blod.

Immunologiska metoder

För varje patient som ingår i studien kommer immunologisk analys av blodprover (24 timmar efter ingreppet eller debut av symtomen) att utföras på Institutionen för fysiologi och immunologi, School of Medicine i Rijeka, Kroatien.

Isolering av mononukleära celler från perifert blod Tjugo milliliter perifert blod kommer att förvärvas i Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), överlagras på Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norge) och centrifugeras (20 min vid 600 g). Efter centrifugeringen kommer cellerna från gränsytan att samlas in och tvättas två gånger i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Auckland, NZ) och användas omedelbart för ytterligare experimentell procedur. Cellernas livsduglighet var >95 % kommer att bedömas med propidiumjodid 0,5 mg/ml/106 celler (Sigma-Aldrich Chemie) och en flödescytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA)

Detektering av cellyta Mononukleära celler från perifert blod (PBMC) kommer att färgas i 30 minuter vid 40 grader Celsius med olika kombinationer av Phycoerythrin (PE) - Cyanine (Cy) anti-kluster av differentiering (CD) 3 monoklonal antikropp (musantikropp (mAb) ), Immunoglobulin G 1 (IgG1)), PE-konjugerad anti-kluster av differentiering (CD)56 mAb (mus B159, IgG1) och fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugerad anti-naturlig mördargrupp 2, medlem D (NKG2D) mAb (5C6). FITC-, PE- och PE-Cy-konjugerade musisotypmatchande antikroppar kommer att användas för att ställa in negativa kontroller för varje klass av antikroppar som används.

Färgade cellprover kommer att analyseras med flödescytometri med FACSCalibur flödescytometer (Becton Dickinson & Co, San Jose, USA).

Detektion av cytokin Interleukin (IL)-1 beta (β) och värmechockprotein (HSP) 70, 27.

För kvantitativ bestämning av human IL-1 β-koncentrationer i plasma kommer Human IL-1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Kit att användas.

För den kvantitativa bestämningen av värmechockprotein (HSP) 70 och 27 i plasma kommer HSP 70 High sensitivity ELISA Kit och HSP 27 ELISA Kit att användas.

Detektion av pentraxin 3 (PTX 3) och prokalcitonin För kvantitativ bestämning av human pentraxin 3 (PTX) och prokalcitoninkoncentrationer i plasmaspecifika ELISA Kit kommer att användas.