Wywołane przez ERCP i wywołane przez ERCP ostre zapalenie trzustki: dwie odrębne jednostki kliniczne i immunologiczne?

PROTOKÓŁ:

Wszyscy pacjenci ze wskazaniami do endoskopowej cholangiopankreatografii wstecznej (ECPW) będą przygotowywani do ECPW według następującego protokołu: zostaną poinstruowani, aby nie jeść od 4 do 6 godzin przed zabiegiem. Bezpośrednio przed zabiegiem zostaną podane wraz z czopkami Diclophenac Sodium 100 mg. Godzinę przed zabiegiem zostanie pobrane 10 ml próbki krwi i próbki moczu, które zostaną poddane analizie w pomieszczeniach laboratoryjnych wchodzących w skład Uniwersyteckiego Centrum Szpitalnego Rijeka pod kątem następujących parametrów: wartości amylazy w surowicy i moczu oraz lipazy w surowicy, testów enzymów wątrobowych i funkcji nerek. 4-6 godzin po wykonaniu ECPW, 10 ml próbki krwi zostanie pobrane i poddane analizie w pomieszczeniach laboratoryjnych wchodzących w skład Uniwersyteckiego Centrum Szpitalnego Rijeka pod kątem następujących parametrów: wartości amylazy w surowicy i moczu oraz lipazy w surowicy, testy enzymów wątrobowych i czynność nerek .

Po 24 godzinach od zabiegu wszystkim pacjentom zostanie pobrane 30 ml heparynizowanej krwi żylnej obwodowej i moczu. 10 ml zostanie przebadane w Zakładzie Medycyny Laboratoryjnej Centrum Szpitala Klinicznego pod kątem następujących parametrów: wartości amylazy w surowicy i moczu oraz lipazy w surowicy, testów enzymów wątrobowych i funkcji nerek. Próbka moczu pobrana po zabiegu zostanie wykorzystana do oceny poziomu amylazy. Pozostałe 20 ml próbek krwi zostanie przesłane do Zakładu Fizjologii i Immunologii Wydziału Lekarskiego, gdzie zostanie przeprowadzona analiza immunologiczna. Wszyscy pacjenci, którzy przeszli ECPW zostaną podzieleni na dwie grupy. Pierwszą grupę (grupę PEP) stanowić będą pacjenci, u których po ECPW rozwinęło się ostre zapalenie trzustki. Po klinicznym i laboratoryjnym potwierdzeniu ostrego zapalenia trzustki, zgodnie z wytycznymi Europejskiego Towarzystwa Endoskopii Przewodu Pokarmowego (ESGE) dla zapalenia trzustki po ERCP, pacjent będzie dalej monitorowany podczas hospitalizacji w celu oceny ciężkości choroby. Ciężkość choroby zostanie oceniona zgodnie z kryteriami Cottona dla ciężkości zapalenia trzustki po ERCP. Grupa pacjentów, u których wykonano ERCP, u których nie wystąpiło ostre zapalenie trzustki w ciągu 24 godzin po zabiegu, zgodnie z wytycznymi ESGE, zostanie potraktowana jako grupa kontrolna (non-PEP group).

Wszyscy pacjenci z ostrym zapaleniem trzustki zgodnie z kryteriami Atlanty przyjmowani przez SOR otrzymają 30 ml heparynizowanej próbki krwi żylnej obwodowej i moczu po 24 godzinach od wystąpienia objawów klinicznych (ból w nadbrzuszu często promieniujący do pleców). 10 ml pobranej krwi zostanie przebadane w Zakładzie Medycyny Laboratoryjnej Centrum Szpitala Klinicznego pod kątem następujących parametrów: wartości amylazy w surowicy i moczu oraz lipazy w surowicy, testów enzymów wątrobowych i funkcji nerek. Pozostałe 20 ml próbek krwi zostanie przesłane do Zakładu Fizjologii i Immunologii Wydziału Lekarskiego, gdzie zostanie przeprowadzona analiza immunologiczna. Ta grupa pacjentów będzie dalej monitorowana podczas hospitalizacji w celu oceny ciężkości choroby. Ciężkość choroby zostanie oceniona zgodnie z kryteriami z Atlanty.

METODY I MATERIAŁY

Parametry laboratoryjne

Dla każdego pacjenta objętego badaniem zostanie wykonane badanie krwi i moczu w Oddziale Medycyny Laboratoryjnej Centrum Szpitala Klinicznego Rijeka. Podstawowe badania hematologiczne będą obejmowały: morfologię krwi - zliczenie ogólnej liczby krwinek czerwonych, krwinek białych i płytek krwi obecnych we krwi, wartości hemoglobiny i hematokrytu. Analiza biochemiczna surowicy krwi obejmie: wartości amylazy i lipazy w surowicy, sód, potas, glukozę, enzymy wątrobowe (aminotransferaza asparaginianowa (AST), aminotransferaza alaninowa (ALT), transferaza gamma-glutamylowa (GGT), fosfataza alkaliczna (ALP) ) bilirubina bezpośrednia i pośrednia, czynność nerek (stężenie mocznika i kreatyniny w surowicy, oszacowana filtracja kłębuszkowa (eGFR)), białko C-reaktywne i stan kwasowo-zasadowy krwi tętniczej.

Metody immunologiczne

Dla każdego pacjenta objętego badaniem analiza immunologiczna próbek krwi (24 godziny po zabiegu lub wystąpieniu objawów) zostanie przeprowadzona w Klinice Fizjologii i Immunologii Akademii Medycznej w Rijece w Chorwacji.

Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej Pobrano dwadzieścia mililitrów krwi obwodowej w Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), nałożono na Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegia) i odwirowano (20 minut przy 600 g). Po odwirowaniu komórki z interfejsu zostaną zebrane i przemyte dwukrotnie w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Auckland, NZ) i natychmiast użyte do dalszej procedury doświadczalnej. Żywotność komórek >95% zostanie oceniona za pomocą jodku propidyny 0,5 mg/ml/106 komórek (Sigma-Aldrich Chemie) i cytometru przepływowego (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA)

Wykrywanie powierzchni komórek Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) będą barwione przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza różnymi kombinacjami fikoerytryny (PE) - cyjaniny (Cy) anty-klaster różnicowania (CD) 3 przeciwciała monoklonalne (mysie przeciwciało (mAb ), Immunoglobulina G 1 (IgG1)), sprzężone z PE anty-klaster różnicowania (CD)56 mAb (mysie B159, IgG1) i skoniugowane z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) grupa 2 anty-naturalnych zabójców, członek D (NKG2D) mAb (5C6). Sprzężone z FITC-, PE- i PE-Cy przeciwciała pasujące do izotypów mysich zostaną użyte do ustawienia kontroli negatywnych dla każdej klasy stosowanych przeciwciał.

Próbki wybarwionych komórek będą analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur (Becton Dickinson & Co, San Jose, USA).

Wykrywanie cytokiny Interleukina (IL)-1 beta (β) i białka szoku cieplnego (HSP) 70, 27.

Do ilościowego oznaczania stężeń ludzkiej IL-1 β w osoczu zostanie użyty zestaw Human IL-1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Do ilościowego oznaczania białka szoku cieplnego (HSP) 70 i 27 w osoczu zostaną użyte zestawy HSP 70 ELISA o wysokiej czułości i zestaw HSP 27 ELISA.

Wykrywanie pentraksyny 3 (PTX 3) i prokalcytoniny Do ilościowego oznaczania stężeń ludzkiej pentraksyny 3 (PTX) i prokalcytoniny w osoczu zostanie użyty zestaw ELISA.